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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 两个酶切位点buffer不同
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假人人

新虫 (小有名气)

[交流] 两个酶切位点buffer不同 已有16人参与

我在构载体的时候，两个酶切位点的buffer不一样，需要先用一个做酶切，然后跑胶回收后再用另一个酶做酶切，然后再跑胶，再回收，可是当我第二次酶切时由于浓度太低，跑胶是几乎都没带，请问各路大神该怎么办？

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1楼 2016-07-11 00:08:20
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
★ ★
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xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-07-11 07:05:08
可以找一个最适合的buffer，有网站专门匹配的。

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2楼2016-07-11 00:35:14
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
你要知道，你每次切胶回收，都是在损耗的产物

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3楼2016-07-11 00:35:57
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781055707

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1，是提高模板浓度。2.用TAKARA的快酶，不用考虑BUFFER
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2016-07-11 09:51:54
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不爱做实验

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1、加大第一次酶切及其回收的量，buffer可以综合考虑两种酶切效率均比较高的那个buffer
2、有时看不清楚条带，但是已知目的条带大小参考mark位置来直接切胶也可以，但不是十分建议这么做。
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5楼2016-07-11 09:57:16
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假人人

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2016-07-11 00:35:14
可以找一个最适合的buffer，有网站专门匹配的。

我用的是NEB的酶，酶切位点分别是Bgl II和Pml I

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6楼2016-07-11 10:03:02
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假人人

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2016-07-11 09:57:16
1、加大第一次酶切及其回收的量，buffer可以综合考虑两种酶切效率均比较高的那个buffer
2、有时看不清楚条带，但是已知目的条带大小参考mark位置来直接切胶也可以，但不是十分建议这么做。

我用的是NEB的酶，酶切位点分别是Bgl II和Pml I。

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7楼2016-07-11 10:05:38
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010308Jing

木虫 (正式写手)
★
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NEB的Cutsmart Buffer或者是Fermantas的Tango Buffer大部分酶都适用的
http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/thermo-scientific-restriction-modifying-enzymes/restriction-enzymes-thermo-scientific/conventional-restriction-enzymes-thermo-scientific/reaction-conditions-for-restriction-enzymes.html
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8楼2016-07-11 14:34:29
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feierorange

铜虫 (小有名气)
★
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如果实在找不到合适的buffer，分步酶切，第一种酶切后，取少量检测，确认切开后，不跑胶，直接回收，在回收产物中加入第二种酶，酶切完成后再最后跑胶。
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9楼2016-07-11 14:46:24
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不爱做实验

银虫 (正式写手)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by 假人人 at 2016-07-11 10:05:38
我用的是NEB的酶，酶切位点分别是Bgl II和Pml I。
...

你看看两种酶公共的buffer要是效率也够高就可以，不行的话就单酶切，回收后再另一种酶切
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10楼2016-07-11 14:56:39
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