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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr条件的问题
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喻德鹏

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr条件的问题 已有1人参与

我把番茄的几个基因重组到pcambia2300表达载体上，转化农杆菌后提取质粒，做pcr，有两个基因都成功p出来了，另一个p不出来。退火温度是58度，是不是要改一改温度？各位大神怎么做的？

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1楼 2016-04-16 20:29:23
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你使用的引物是对应基因的特异性引物？还是载体上的通用引物？如果是特异性引物，对应该基因能不能找到一个阳性对照？就是找个模板可以扩增出来该基因的。因为你现在挑取的是克隆，是不是正确的克隆还不知道，所以究竟是引物问题还是克隆本身就不正导致这样结果，你是需要借助阳性对照的。如果是载体上的通用引物，那么其他两个基因可以扩增，只有这个不行，推断应该是你克隆不正确，引物的问题应该不大，祝好！

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
2楼2016-04-16 21:31:55
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sayen

银虫 (小有名气)
既然是克隆到载体上的基因应该测过序吧，如果质粒确定没问题用基因特异性引物应该能p出来，毕竟是直接从质粒是p

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3楼2016-04-17 00:25:49
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喻德鹏

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-04-16 21:31:55
你使用的引物是对应基因的特异性引物？还是载体上的通用引物？如果是特异性引物，对应该基因能不能找到一个阳性对照？就是找个模板可以扩增出来该基因的。因为你现在挑取的是克隆，是不是正确的克隆还不知道，所以究 ...

三个基因都是各自的特异性引物，单菌落用质粒上两种抗性筛选都可以存活。

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4楼2016-04-17 07:18:44
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
喻德鹏: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-04-17 22:24:59
引用回帖:
4楼: Originally posted by 喻德鹏 at 2016-04-17 07:18:44
三个基因都是各自的特异性引物，单菌落用质粒上两种抗性筛选都可以存活。
...

哦，如果特异性引物，你之前有用这个引物进行扩增目的条带么？还是这是第一次使用这个引物？你的单菌落有两种抗性只能说你的质粒进去了，但不能说明上面一定有你的目的基因了

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喻德鹏
天空才是极限，我有信心飞的更高！
5楼2016-04-17 14:17:48
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喻德鹏

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-04-17 14:17:48
哦，如果特异性引物，你之前有用这个引物进行扩增目的条带么？还是这是第一次使用这个引物？你的单菌落有两种抗性只能说你的质粒进去了，但不能说明上面一定有你的目的基因了
...

引物刚刚合成好，第一次用，之前导入的质粒也是生物公司合成的。我回头用之前提取的质粒做个pcr看看。

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6楼2016-04-17 22:24:45
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风信子寻梦

木虫 (职业作家)
做一个退货梯度试试，确定一个最佳退货温度！

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7楼2016-04-18 22:55:34
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