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xurong1127

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR问题

各位大侠,谁能帮帮我啊!我构建MMP7质粒,克隆全长.上游引物:MMP7-F: 5’ CGGGATCCATC AAC CAT AGG TCC AAG AAC 3’
酶: BamHI
MMP7-R: 5’CGGAATTCTTT CTT TCT TGA ATT ACT TCT C 3’
酶: ECOR I
普通PCR根本做不出,模板换了好几种,用Touchdown可以做出淡淡的调带
我的反应条件是:95℃  3分钟  ,95℃ 45s  60-50℃逐渐降温 30s ,72℃ 1分钟,然后50℃
30个循环,  72℃ 10分钟  ,谁能帮我想想还有别的好办法吗? 我的引物也换过一次,之前的引物也是各种方法都试了!就是做出不去
我的反应体系  25微升  水 16.85  ,dNTP 4,  10xbf 2.5, 引物 1 0.2, 引物2 0.2  ,Taq酶 0.25 CDNA 1  ,

[ Last edited by xurong1127 on 2013-4-18 at 16:40 ]
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xurong1127

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1楼 2013-04-18 16:32:58
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回帖置顶 ( 共有1个 )

panyuzhu

禁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-18 20:12:07
问题都问不清楚
1.你的模板是什么啊？
       “模板换了好几种”这也叫线索啊？
2.你的目的是什么啊？
      “我构建MMP7质粒,克隆全长”，这也叫目的啊，MMP7是什么啊，克隆全长？那你直接转化质粒，提质粒，做个single digest不就是全长了。
3.实验情况是什么啊？
     “淡淡的条带”，你以为淡淡的忧伤啊。有条带你丫难道还P不出来了？（是条带，不是调）
4.你要P的目的条带全长基因多少啊？
     “95℃  3分钟  ,95℃ 45s  60-50℃逐渐降温 30s ,72℃ 1分钟,然后50℃
30个循环,  72℃ 10分钟  ”你确定45s，30s，1min分分钟能搞出下一代吗
5.反应30个循环，引物你加0.2ul？你看是不是太抠了点
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3楼2013-04-18 18:14:45
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
xurong1127: 金币+2, ★有帮助, 觉得楼主很热情!谢谢 2013-04-22 08:53:07
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-09 20:48:57
引用回帖:
9楼: Originally posted by xurong1127 at 2013-04-19 12:51:33
我用的就是降落PCR哦 ，普通PCR做了好久做不出，用降落PCR才出来一弱弱的影子，我想着是不是可以怎么优化下条件啊？您有什么高见呢！谁知道这基因这么难搞定！...

重新看了下你的体系，你的引物量是不是用得太少了，我们12.5ul的体系引物都是0.5ul。。。你的TM值多高呢？可不可以把退火温度提高点同时引物量多点呢？
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keepon
10楼2013-04-20 09:16:23
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-05-09 20:49:06
把你图片发过来看看，用二次PCR试试。你的引物合成单是什么？引物稀释浓度是多少？哪个公司的酶？dNTP浓度是多少？发信息具体点好分析问题！！！
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14楼2013-04-22 16:29:52
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

图片发过来 你信息发的还是不具体。具体细节都没有。
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17楼2013-04-24 10:03:52
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普通回帖

zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么要克隆全长呢？
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keepon
2楼2013-04-18 18:07:21
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xurong1127

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-04-18 18:07:21
为什么要克隆全长呢？

我导师安排的,我也跟她说过,好多人构建这个基因质粒的,都不是全长呢!您有什么好办法吗?我都PCR一个月了,超级郁闷.
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努力就有收获
4楼2013-04-19 08:58:29
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-05-09 20:49:19
引用回帖:
4楼: Originally posted by xurong1127 at 2013-04-19 08:58:29
我导师安排的,我也跟她说过,好多人构建这个基因质粒的,都不是全长呢!您有什么好办法吗?我都PCR一个月了,超级郁闷....

那你可以用重叠延伸PCR试一下，分段P。。。然后重叠延伸试下。。。多长呢？一般太长可以采用这种方法。
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keepon
5楼2013-04-19 09:12:23
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xurong1127

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by panyuzhu at 2013-04-18 18:14:45
问题都问不清楚
1.你的模板是什么啊？
       “模板换了好几种”这也叫线索啊？
2.你的目的是什么啊？
      “我构建MMP7质粒,克隆全长”，这也叫目的啊，MMP7是什么啊，克隆全长？那你直接转化质粒，提质粒， ...

1.我用的模板有:胶质瘤  H4细胞,肺小细胞癌H1299, 胃癌  AGS,肠癌 HT-29, 肾癌 293T,还有文库买的脑组织的,还有一个不知道是什么也是文库买的,我看了别人的文献,按道理这些癌里面都有这基因表达的,我们实验室都用这几种模板的.
2. 问题是我们没有MMP7质粒
3.MMP7基因全长780左右
4.引物加0.2差不多了吧!我克隆过CD24,才加0.1,也出来了哦!发现这基因太不好了,上面G多,下面T多, 怎么设计引物都有错配的出现.
还有我以前的引物是

MMP7:
MMP7-F: 5’ GGGGTACCGCGA CTC ACC GTG CTG TGT GCT GT 3’
酶:  Kpn1
MMP7-R: CGGAATTC CTA TTT CTT TCT TGA ATT ACT TCTCT 3’
酶: ECOR I
请问您有什么好办法吗?
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6楼2013-04-19 09:16:10
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xurong1127

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-04-19 09:12:23
那你可以用重叠延伸PCR试一下，分段P。。。然后重叠延伸试下。。。多长呢？一般太长可以采用这种方法。...

不长啊!才780左右啊
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7楼2013-04-19 09:21:21
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-05-09 20:49:29
引用回帖:
7楼: Originally posted by xurong1127 at 2013-04-19 09:21:21
不长啊!才780左右啊...

那可以用降落PCR试试。。。还有考虑下2楼为你提出的那些问题。。。问得都挺好的。。。
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8楼2013-04-19 09:58:59
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xurong1127

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-04-19 09:58:59
那可以用降落PCR试试。。。还有考虑下2楼为你提出的那些问题。。。问得都挺好的。。。...

我用的就是降落PCR哦 ，普通PCR做了好久做不出，用降落PCR才出来一弱弱的影子，我想着是不是可以怎么优化下条件啊？您有什么高见呢！谁知道这基因这么难搞定！
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9楼2013-04-19 12:51:33
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