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xurong1127

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR问题

各位大侠,谁能帮帮我啊!我构建MMP7质粒,克隆全长.上游引物:MMP7-F: 5’ CGGGATCCATC AAC CAT AGG TCC AAG AAC 3’
酶: BamHI
MMP7-R: 5’CGGAATTCTTT CTT TCT TGA ATT ACT TCT C 3’
酶: ECOR I
普通PCR根本做不出,模板换了好几种,用Touchdown可以做出淡淡的调带
我的反应条件是:95℃  3分钟  ,95℃ 45s  60-50℃逐渐降温 30s ,72℃ 1分钟,然后50℃
30个循环,  72℃ 10分钟  ,谁能帮我想想还有别的好办法吗? 我的引物也换过一次,之前的引物也是各种方法都试了!就是做出不去
我的反应体系  25微升  水 16.85  ,dNTP 4,  10xbf 2.5, 引物 1 0.2, 引物2 0.2  ,Taq酶 0.25 CDNA 1  ,

[ Last edited by xurong1127 on 2013-4-18 at 16:40 ]
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xurong1127

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努力就有收获
1楼 2013-04-18 16:32:58
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xurong1127

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-04-18 18:07:21
为什么要克隆全长呢？

我导师安排的,我也跟她说过,好多人构建这个基因质粒的,都不是全长呢!您有什么好办法吗?我都PCR一个月了,超级郁闷.
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努力就有收获
4楼2013-04-19 08:58:29
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么要克隆全长呢？
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keepon
2楼2013-04-18 18:07:21
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panyuzhu

禁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-18 20:12:07
问题都问不清楚
1.你的模板是什么啊？
       “模板换了好几种”这也叫线索啊？
2.你的目的是什么啊？
      “我构建MMP7质粒,克隆全长”，这也叫目的啊，MMP7是什么啊，克隆全长？那你直接转化质粒，提质粒，做个single digest不就是全长了。
3.实验情况是什么啊？
     “淡淡的条带”，你以为淡淡的忧伤啊。有条带你丫难道还P不出来了？（是条带，不是调）
4.你要P的目的条带全长基因多少啊？
     “95℃  3分钟  ,95℃ 45s  60-50℃逐渐降温 30s ,72℃ 1分钟,然后50℃
30个循环,  72℃ 10分钟  ”你确定45s，30s，1min分分钟能搞出下一代吗
5.反应30个循环，引物你加0.2ul？你看是不是太抠了点
赞一下(2人) 回复此楼
欢迎交流
3楼2013-04-18 18:14:45
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-05-09 20:49:19
引用回帖:
4楼: Originally posted by xurong1127 at 2013-04-19 08:58:29
我导师安排的,我也跟她说过,好多人构建这个基因质粒的,都不是全长呢!您有什么好办法吗?我都PCR一个月了,超级郁闷....

那你可以用重叠延伸PCR试一下，分段P。。。然后重叠延伸试下。。。多长呢？一般太长可以采用这种方法。
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keepon
5楼2013-04-19 09:12:23
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