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xurong1127新虫 (初入文坛)
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PCR问题
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各位大侠,谁能帮帮我啊!我构建MMP7质粒,克隆全长.上游引物:MMP7-F: 5’ CGGGATCCATC AAC CAT AGG TCC AAG AAC 3’ 酶: BamHI MMP7-R: 5’CGGAATTCTTT CTT TCT TGA ATT ACT TCT C 3’ 酶: ECOR I 普通PCR根本做不出,模板换了好几种,用Touchdown可以做出淡淡的调带 我的反应条件是:95℃ 3分钟 ,95℃ 45s 60-50℃逐渐降温 30s ,72℃ 1分钟,然后50℃ 30个循环, 72℃ 10分钟 ,谁能帮我想想还有别的好办法吗? 我的引物也换过一次,之前的引物也是各种方法都试了!就是做出不去 我的反应体系 25微升 水 16.85 ,dNTP 4, 10xbf 2.5, 引物 1 0.2, 引物2 0.2 ,Taq酶 0.25 CDNA 1 , [ Last edited by xurong1127 on 2013-4-18 at 16:40 ] |
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【答案】应助回帖
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amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-18 20:12:07
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问题都问不清楚 1.你的模板是什么啊？ “模板换了好几种”这也叫线索啊？ 2.你的目的是什么啊？ “我构建MMP7质粒,克隆全长”，这也叫目的啊，MMP7是什么啊，克隆全长？那你直接转化质粒，提质粒，做个single digest不就是全长了。 3.实验情况是什么啊？ “淡淡的条带”，你以为淡淡的忧伤啊。有条带你丫难道还P不出来了？（是条带，不是调） 4.你要P的目的条带全长基因多少啊？ “95℃ 3分钟 ,95℃ 45s 60-50℃逐渐降温 30s ,72℃ 1分钟,然后50℃ 30个循环, 72℃ 10分钟 ”你确定45s，30s，1min分分钟能搞出下一代吗 5.反应30个循环，引物你加0.2ul？你看是不是太抠了点 |
3楼2013-04-18 18:14:45
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10楼2013-04-20 09:16:23
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17楼2013-04-24 10:03:52
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4楼2013-04-19 08:58:29
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5楼2013-04-19 09:12:23
xurong1127
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1.我用的模板有:胶质瘤 H4细胞,肺小细胞癌H1299, 胃癌 AGS,肠癌 HT-29, 肾癌 293T,还有文库买的脑组织的,还有一个不知道是什么也是文库买的,我看了别人的文献,按道理这些癌里面都有这基因表达的,我们实验室都用这几种模板的. 2. 问题是我们没有MMP7质粒 3.MMP7基因全长780左右 4.引物加0.2差不多了吧!我克隆过CD24,才加0.1,也出来了哦!发现这基因太不好了,上面G多,下面T多, 怎么设计引物都有错配的出现. 还有我以前的引物是 MMP7: MMP7-F: 5’ GGGGTACCGCGA CTC ACC GTG CTG TGT GCT GT 3’ 酶: Kpn1 MMP7-R: CGGAATTC CTA TTT CTT TCT TGA ATT ACT TCTCT 3’ 酶: ECOR I 请问您有什么好办法吗? |
6楼2013-04-19 09:16:10
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8楼2013-04-19 09:58:59
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9楼2013-04-19 12:51:33