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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR问题
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xurong1127

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-04-20 09:16:23
重新看了下你的体系，你的引物量是不是用得太少了，我们12.5ul的体系引物都是0.5ul。。。你的TM值多高呢？可不可以把退火温度提高点同时引物量多点呢？...

我的引物浓度时25um/L哦,我前天把引物量加到了0.5ul,变成了涂抹带,退火温度 ,我自己做了温度梯度的在59度左右,引物单子上是: F:Tm(50mMNa) 57.8  下游: Tm(50mMNa):51.1  想问下你以前出现过PCR 做不出来的现象吗?怎么解决的呢
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11楼2013-04-22 08:52:24
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-05-09 20:49:43
引用回帖:
11楼: Originally posted by xurong1127 at 2013-04-22 08:52:24
我的引物浓度时25um/L哦,我前天把引物量加到了0.5ul,变成了涂抹带,退火温度 ,我自己做了温度梯度的在59度左右,引物单子上是: F:Tm(50mMNa) 57.8  下游: Tm(50mMNa):51.1  想问下你以前出现过PCR 做不出来的现象吗? ...

你这对引物的Tm值怎么相差这么大呢？一般不要超过5度呢。。。总的来说如果引物特异性不好的话 降落应该挺管用的 万一不行你真的可以用重叠延伸试一下吧 我以前P较长片段的时候用过重叠延伸PCR。。。
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keepon
12楼2013-04-22 09:40:41
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xurong1127

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
觉得楼主超热心!
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13楼2013-04-22 16:02:49
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-05-09 20:49:06
把你图片发过来看看，用二次PCR试试。你的引物合成单是什么？引物稀释浓度是多少？哪个公司的酶？dNTP浓度是多少？发信息具体点好分析问题！！！
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14楼2013-04-22 16:29:52
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xurong1127

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zhlf1989513 at 2013-04-22 09:40:41
你这对引物的Tm值怎么相差这么大呢？一般不要超过5度呢。。。总的来说如果引物特异性不好的话 降落应该挺管用的 万一不行你真的可以用重叠延伸试一下吧 我以前P较长片段的时候用过重叠延伸PCR。。。...

如果做Touchdown 你会用什么样的条件呢?我用的是60度-50度, 降一度一个循环,50度  30个循环, 不行啊!后来我提高到  63度-47度 降2度3个循环,55度10个循环都不行啊!我都P了一个月,什么两步法都用了 ,就是做不出,引物也换了一次,我都快郁闷死了!
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15楼2013-04-22 17:32:56
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xurong1127

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by wangqi1107 at 2013-04-22 16:29:52
把你图片发过来看看，用二次PCR试试。你的引物合成单是什么？引物稀释浓度是多少？哪个公司的酶？dNTP浓度是多少？发信息具体点好分析问题！！！

二次PCR我也做了,涂抹带,酶是TaKaRa公司的
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16楼2013-04-22 17:34:30
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

图片发过来 你信息发的还是不具体。具体细节都没有。
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17楼2013-04-24 10:03:52
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xurong1127

新虫 (初入文坛)
同志们，我构建MMP7质粒做出来了，我第一次设计引物，在编码区量两头，两尾找的，第二次把上游编码区提前了一些，我做出来的这次就是在下游编码区外找的合适的，PCR，一次就P出来了。所以我建议构建质粒的同志们，当编码区两头，两尾不好时，也到编码区外面去找。
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18楼2013-05-09 17:35:33
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