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xurong1127新虫 (初入文坛)
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[求助]
PCR问题
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各位大侠,谁能帮帮我啊!我构建MMP7质粒,克隆全长.上游引物:MMP7-F: 5’ CGGGATCCATC AAC CAT AGG TCC AAG AAC 3’ 酶: BamHI MMP7-R: 5’CGGAATTCTTT CTT TCT TGA ATT ACT TCT C 3’ 酶: ECOR I 普通PCR根本做不出,模板换了好几种,用Touchdown可以做出淡淡的调带 我的反应条件是:95℃ 3分钟 ,95℃ 45s 60-50℃逐渐降温 30s ,72℃ 1分钟,然后50℃ 30个循环, 72℃ 10分钟 ,谁能帮我想想还有别的好办法吗? 我的引物也换过一次,之前的引物也是各种方法都试了!就是做出不去 我的反应体系 25微升 水 16.85 ,dNTP 4, 10xbf 2.5, 引物 1 0.2, 引物2 0.2 ,Taq酶 0.25 CDNA 1 , [ Last edited by xurong1127 on 2013-4-18 at 16:40 ] |
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zhlf1989513
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10楼2013-04-20 09:16:23
zhlf1989513
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2楼2013-04-18 18:07:21
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-18 20:12:07
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amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-18 20:12:07
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问题都问不清楚 1.你的模板是什么啊？ “模板换了好几种”这也叫线索啊？ 2.你的目的是什么啊？ “我构建MMP7质粒,克隆全长”，这也叫目的啊，MMP7是什么啊，克隆全长？那你直接转化质粒，提质粒，做个single digest不就是全长了。 3.实验情况是什么啊？ “淡淡的条带”，你以为淡淡的忧伤啊。有条带你丫难道还P不出来了？（是条带，不是调） 4.你要P的目的条带全长基因多少啊？ “95℃ 3分钟 ,95℃ 45s 60-50℃逐渐降温 30s ,72℃ 1分钟,然后50℃ 30个循环, 72℃ 10分钟 ”你确定45s，30s，1min分分钟能搞出下一代吗 5.反应30个循环，引物你加0.2ul？你看是不是太抠了点 |
3楼2013-04-18 18:14:45
xurong1127
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4楼2013-04-19 08:58:29
