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qll8384

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR问题 已有3人参与

真菌基因组能够P出ITS序列，但是其余序列比如EF1-α，mtSSU等，都不能P出来？这是为啥呢？
有谁遇到过这样的事情？！
但是，有时候，重复相同的条件，相同的体系，尽然能出来一部分。
是在让人捉摸不透啊。
各位虫友，我们一般做25微升体系。EF1-α退火温度在53℃，时间是30s，有什么不妥的吗？
实验前期，P出来的相当顺利，后期，几乎不能出。
求原因。
谢谢大神哦
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1楼 2015-01-13 22:52:16
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:01:32
先缓一缓，分子实验就是这样，别担心，换个PCR体系试一试看看可以不哈，还有就是做PCR的体系是不是放置的时间长了，效果不好了，也可以拿个新的重复一下，祝你好运哈。
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坚持到底就是胜利！
2楼2015-01-13 23:13:50
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:01:41
对的，分子实验就是这样，看不见摸不着的，有时候说明都是好的，就是不出来结果，呵呵。多做几次。
退火温度53℃30s，25微升的体系没有什么不妥。（退火温度要根据你的引物确定）

还有，你是扩增一个真菌基因组DNA上的多少个序列？一共设计了多少对引物呢？
扩增大于2个序列以上的话，要多重PCR，不然扩不出来的，希望对你有所帮助
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-01-14 09:42:32
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cosign

木虫 (正式写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:01:50
前期能P出来，现在P不出来了，估计是基因组出问题了，重新提一下基因组看看
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4楼2015-01-14 16:35:05
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qll8384

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cosign at 2015-01-14 16:35:05
前期能P出来，现在P不出来了，估计是基因组出问题了，重新提一下基因组看看

基因组的问题，我们已经重提过两次，但是还是一样的结果。不过最近有个事情，特别奇怪。实验室只有一个人能够P出来，其余的都表示很痛苦。这个着实解释不出来啊。我们用的药品，体系，PCR条件都一样。
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5楼2015-01-16 09:27:20
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qll8384

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kuaile5420 at 2015-01-13 23:13:50
先缓一缓，分子实验就是这样，别担心，换个PCR体系试一试看看可以不哈，还有就是做PCR的体系是不是放置的时间长了，效果不好了，也可以拿个新的重复一下，祝你好运哈。

谢谢，我也是决定，暂停试验。回头重看吧。
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6楼2015-01-16 09:30:28
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qll8384

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-01-14 09:42:32
对的，分子实验就是这样，看不见摸不着的，有时候说明都是好的，就是不出来结果，呵呵。多做几次。
退火温度53℃30s，25微升的体系没有什么不妥。（退火温度要根据你的引物确定）

还有，你是扩增一个真菌基因组 ...

对了，你提到多重PCR，这个我也做了。但是我的序列是一条的。不过，这个确实出了几个条带。但是有些事非特异性的。在纯化上，个条带距离不是很大，亮度都差不都。所以就放弃了。谢谢你了
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7楼2015-01-16 09:32:14
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
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5楼: Originally posted by qll8384 at 2015-01-16 09:27:20
基因组的问题，我们已经重提过两次，但是还是一样的结果。不过最近有个事情，特别奇怪。实验室只有一个人能够P出来，其余的都表示很痛苦。这个着实解释不出来啊。我们用的药品，体系，PCR条件都一样。...

引物也是一样的？如果引物也是一样的话。。嘿嘿，那就先缓缓在做吧
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
8楼2015-01-16 09:40:40
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qll8384

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-01-16 09:40:40
引物也是一样的？如果引物也是一样的话。。嘿嘿，那就先缓缓在做吧...

引物却是一样，我估计是药品出问题了。
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9楼2015-01-16 10:15:48
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