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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » cDNA PCR扩增问题
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含羞草liu

新虫 (小有名气)

[求助] cDNA PCR扩增问题

我提取了RNA，用生工M－MuLV第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，然后用CODEHOP法设计的简并引物进行PCR扩增。
  之前，我用三步法PCR，结果电泳检测要么无条带，要么只有一条带（小于100bp，很可能是引物二聚体），要么两条带（一条大于100bp，一条小于100bp），更换PCR条件和引物，仍然这个结果。
  后来，我尝试采用两步法PCR。PCR体系是25ul。PCR条件是：94度预变性3min。94度变性1min，68度退火延伸1min，进行30个循环。然后72度保温10min。扩增结果电泳检测只有一个条带，小于100bp，可能是引物二聚体。改变PCR条件，94度变性45s，68度退火延伸1min45s，进行30个循环，扩增结果电泳检测也是只有一个条带，小于100bp。更换不同的引物，PCR结果要么只有小于100bp的一条带，要么没有条带。
补充：
我待扩增的序列未知，所以对引物的设计是用CODEHOP法，通过对近缘种进行序列比对，找到保守区，再利用保守区的序列设计的简并引物。对引物的筛选是用Oligo 6软件。对目的片段大小的估计也是使用近缘种与引物的结合情况进行预测的。

出现这样的结果，是引物的问题，还是PCR条件的问题？我已进行了很多尝试，仍然得不到理想的结果。请各位帮个忙，感激不尽！！！
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1楼 2012-06-07 10:39:05
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yunzhifei

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-07 14:00:56
（一条大于100bp，一条小于100bp），如果大于100bp的条带小于200bp，可能还是引物二聚体（特征，条带弥散）。看你说的情况可能是反转录没成功，可能是引物不够特异，更可能是模板降解，RNA很容易降解的
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含羞草liu
2楼2012-06-07 11:07:46
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by yunzhifei at 2012-06-07 11:07:46
（一条大于100bp，一条小于100bp），如果大于100bp的条带小于200bp，可能还是引物二聚体（特征，条带弥散）。看你说的情况可能是反转录没成功，可能是引物不够特异，更可能是模板降解，RNA很容易降解的

一般情况下，引物二聚体只有一条带呀，而且条带很弥散。而我得到的条带看上去很清晰，如下图所示。可能是扩出来的短片段吗？

PCR电泳结果
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努力，奋斗，拼搏。。。
3楼2012-06-08 08:50:51
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