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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助一个pcr条件的问题
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pop_hjx_41

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】求助一个pcr条件的问题 已有5人参与

想求助两个pcr条件的问题：
1.我的两端引物tm都是57，在设定尝试退火温度的时候应该设定在多少合适呢？
2.关于延伸 和退火的时间是不是和片段的长度有关系呢 特别是延伸时间是怎么算出来的呢（用Dreamtaq）我的片段在600bp左右，请问应该设定在多少比较合适？如果过长了会有什么影响呢
呵呵 新手提问 麻烦各位高手作答了
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1楼 2010-09-21 17:04:14
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
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lstt09nk(金币+1):热心 2010-09-21 20:00:11
1、用50mM Na+的Tm值作参考，把这个Tm加5~10度即可。不同离子强度下的Tm是不一样的~
2、一般按1kb/min来算。600bp设个40秒足够了
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2楼2010-09-21 19:45:22
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小小豆豆

金虫 (小有名气)
★
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楼上的退火温度计算反了，应该是减5至10度。
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3楼2010-09-21 22:42:05
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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引用回帖:
Originally posted by 小小豆豆 at 2010-09-21 22:42:05:
楼上的退火温度计算反了，应该是减5至10度。

没有反，你说的减，是传统的以设计软件PP5给出的Tm做参考的
而事实上，按照我的个人经验，按照PP5的Tm减5做出来的效果不好，比如做半定量，经常有dimer
还不如参考50mM Na+的Tm来加5~10，适用克隆和实时定量级的实验
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4楼2010-09-21 23:42:49
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dingyanhua

铜虫 (小有名气)
★
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还是做个温度梯度比较好
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5楼2010-09-22 09:39:44
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aaron2012

银虫 (初入文坛)
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做个温度梯度   
一般都是1分钟1Kbp  所以延伸一分钟就够了
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生物，特别是分子生物，贵在坚持！
6楼2010-09-23 10:14:32
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雕刻你的拾光

新虫 (初入文坛)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖提问 2016-08-09 08:12:08
退火温度一般比TM低5到10度，你可以设置成52，还可以做个梯度pcr摸索一下最佳的退火温度，延伸时间一般根据你的片段长度和酶来计算，一般taq酶一分钟合成大约1000bp，你的设置45s就差不多了，长了会降低pcr的准确性，产生非特异的条带
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7楼2016-08-07 21:09:43
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