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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请问我做pcr的时候有条带，但是胶回收的时候怎么没条带了啊
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雨落wang

新虫 (初入文坛)

[交流] 请问我做pcr的时候有条带，但是胶回收的时候怎么没条带了啊

请问我做pcr的时候有条带，但是胶回收的时候怎么没条带了啊？

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1楼 2016-04-07 17:30:17
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sandycool

铁虫 (正式写手)
★
雨落wang(金币+1): 谢谢参与
胶回收操作的问题

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6楼2016-04-08 09:01:09
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-04-07 18:05:44
你切胶的时候有条带么？如果有，就是回收过程中出问题了

切的时候有啊，回收的时候也按照说明进行的，都做过几次重复了！

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12楼2016-04-08 19:29:12
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原海亮

木虫 (著名写手)
★
雨落wang(金币+1): 谢谢参与
你切胶的时候有条带么？如果有，就是回收过程中出问题了

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3楼2016-04-07 18:05:44
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屋檐下的等待

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
回收没有的肯定是回收过程的问题了

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7楼2016-04-08 09:07:05
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仇峰12306

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
回收之后没有嘛？是不是试剂盒污染了
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8楼2016-04-08 09:10:24
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310013

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主确定你看到的是条带而不是某些非特异性的东西？不是每个可以看到的 都是核酸条带
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9楼2016-04-08 12:26:38
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松风山人

铜虫 (小有名气)
胶回出了问题

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10楼2016-04-08 12:36:52
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781055707

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你用的是PET系列吧，我一般切4管50UL的体系，胶回收后跑电泳才勉强看得见。
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11楼2016-04-08 14:13:33
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by sandycool at 2016-04-08 09:01:09
胶回收操作的问题

是按说明书进行的啊

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13楼2016-04-08 19:29:54
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 仇峰12306 at 2016-04-08 09:10:24
回收之后没有嘛？是不是试剂盒污染了

新买的盒子啊

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14楼2016-04-08 19:30:30
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 310013 at 2016-04-08 12:26:38
楼主确定你看到的是条带而不是某些非特异性的东西？不是每个可以看到的 都是核酸条带

就是最下面这条最亮的条带啊
请问我做pcr的时候有条带，但是胶回收的时候怎么没条带了啊



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15楼2016-04-08 19:33:47
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 781055707 at 2016-04-08 14:13:33
你用的是PET系列吧，我一般切4管50UL的体系，胶回收后跑电泳才勉强看得见。

上面没说体系啊，就是用的天根的试剂盒

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16楼2016-04-08 19:35:35
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原海亮

木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
12楼: Originally posted by 雨落wang at 2016-04-08 19:29:12
切的时候有啊，回收的时候也按照说明进行的，都做过几次重复了！
...

你那条带浓度太低了，pcr特异性也不好，先把pcr产物浓度提高一下

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17楼2016-04-08 22:38:10
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shx0743

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
胶回收之前条带亮么，我以前粗略算过，胶回收效率只有20％，如果你胶回收的带子就不是很明显，那么回收回来的可能性不大！

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18楼2016-04-08 22:56:16
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-04-08 22:38:10
你那条带浓度太低了，pcr特异性也不好，先把pcr产物浓度提高一下
...

请问浓度怎么提高啊？

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19楼2016-04-08 22:56:34
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by shx0743 at 2016-04-08 22:56:16
胶回收之前条带亮么，我以前粗略算过，胶回收效率只有20％，如果你胶回收的带子就不是很明显，那么回收回来的可能性不大！

条带只有这么亮
请问我做pcr的时候有条带，但是胶回收的时候怎么没条带了啊-1



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20楼2016-04-08 22:59:35
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sunqx

木虫 (著名写手)
有带较弱

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21楼2016-04-08 23:00:26
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by sunqx at 2016-04-08 23:00:26
有带较弱

就是，加了6微升的模版，50微的体系，

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22楼2016-04-08 23:04:10
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sunqx

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你这总共也就二三十ng,能回收回十就了不得了，加三十的水，浓度才三分之一ngul

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23楼2016-04-08 23:09:21
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
23楼: Originally posted by sunqx at 2016-04-08 23:09:21
你这总共也就二三十ng,能回收回十就了不得了，加三十的水，浓度才三分之一ngul

那我是应该增加模版的量吗？

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24楼2016-04-08 23:13:40
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shx0743

新虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
20楼: Originally posted by 雨落wang at 2016-04-08 22:59:35
条带只有这么亮

...

那肯定不行，上样几微？如果是5ul的话，你多做几管吧，摸一下退火温度，看看哪个温度条带更清晰，我每次p，上样3ul，跑出的带子比marker中最亮的条带亮都要做2管以上才会去胶回收

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25楼2016-04-09 06:16:01
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雨落wang

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引用回帖:
25楼: Originally posted by shx0743 at 2016-04-09 06:16:01
那肯定不行，上样几微？如果是5ul的话，你多做几管吧，摸一下退火温度，看看哪个温度条带更清晰，我每次p，上样3ul，跑出的带子比marker中最亮的条带亮都要做2管以上才会去胶回收
...

哦，好的，谢谢

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26楼2016-04-09 08:19:19
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 雨落wang at 2016-04-09 08:19:19
哦，好的，谢谢
...

我上样6微，50微体系做的pcr

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27楼2016-04-09 08:20:37
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仇峰12306

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by 雨落wang at 2016-04-08 19:30:30
新买的盒子啊
...

你用这个回收过别的吗？如果别的没问题，那试剂盒没问题。还有就是看到你的图，感觉你的条带特别暗，你需要的主带大概在多少啊？
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28楼2016-04-09 09:20:40
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黄启秀

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也有同样问题，楼主解决了么～苦恼

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29楼2016-04-09 09:53:27
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 仇峰12306 at 2016-04-09 09:20:40
你用这个回收过别的吗？如果别的没问题，那试剂盒没问题。还有就是看到你的图，感觉你的条带特别暗，你需要的主带大概在多少啊？...

70bp左右

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30楼2016-04-09 10:07:44
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
29楼: Originally posted by 黄启秀 at 2016-04-09 09:53:27
我也有同样问题，楼主解决了么～苦恼

没有，苦恼中

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31楼2016-04-09 10:08:15
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 仇峰12306 at 2016-04-09 09:20:40
你用这个回收过别的吗？如果别的没问题，那试剂盒没问题。还有就是看到你的图，感觉你的条带特别暗，你需要的主带大概在多少啊？...

还没回收过其他的

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32楼2016-04-09 10:08:57
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仇峰12306

铁虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
30楼: Originally posted by 雨落wang at 2016-04-09 10:07:44
70bp左右
...

我们回收的片段如果太小的话，我们用的是生工的，说明书上写着需要加异丙醇好像。而且你的片段这么小孩不太亮，如果做PCR方便的话可以多做几个，或者将PCR产物浓缩下试试，切胶点样的时候多点几微升。然后过一个柱子试试。切胶回收效率不管是哪家好像都不太高。
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33楼2016-04-09 10:46:39
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
33楼: Originally posted by 仇峰12306 at 2016-04-09 10:46:39
我们回收的片段如果太小的话，我们用的是生工的，说明书上写着需要加异丙醇好像。而且你的片段这么小孩不太亮，如果做PCR方便的话可以多做几个，或者将PCR产物浓缩下试试，切胶点样的时候多点几微升。然后过一个柱 ...

Pcr产物怎么浓缩啊？

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34楼2016-04-09 11:03:22
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仇峰12306

铁虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
34楼: Originally posted by 雨落wang at 2016-04-09 11:03:22
Pcr产物怎么浓缩啊？
...

就是你PCR产物洗涤吗?我们之前就是洗涤完了之后加水的时候少加点之前如果是50的话之后就加20-30。但是我们没做过70bp的，我们有200.300的时候一般洗完后加20的水
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35楼2016-04-09 14:26:47
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雨落wang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
35楼: Originally posted by 仇峰12306 at 2016-04-09 14:26:47
就是你PCR产物洗涤吗?我们之前就是洗涤完了之后加水的时候少加点之前如果是50的话之后就加20-30。但是我们没做过70bp的，我们有200.300的时候一般洗完后加20的水...

哦，好的，谢谢

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36楼2016-04-09 14:49:34
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小林樱雪

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送红花一朵
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1楼: Originally posted by 雨落wang at 2016-04-07 17:30:17
请问我做pcr的时候有条带，但是胶回收的时候怎么没条带了啊？

有没有可能是切错了

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37楼2016-04-09 16:29:28
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雨落wang

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引用回帖:
37楼: Originally posted by 小林樱雪 at 2016-04-09 16:29:28
有没有可能是切错了
...

应该不会吧，跟文献上产物大小差不多的位置啊

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38楼2016-04-09 19:59:20
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Gao-Rui

新虫 (初入文坛)
★
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问题不清楚，说的再细点。是胶回收之后嘛？
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39楼2016-04-09 22:08:27
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781055707

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引用回帖:
16楼: Originally posted by 雨落wang at 2016-04-08 19:35:35
上面没说体系啊，就是用的天根的试剂盒
...

70BP还胶回收呀，那个膜会过滤掉100BP以下的条带的，连T载体吧，设计下思路看行不行，200BP以下都可能是引物二聚体。
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40楼2016-04-10 03:37:21
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雨落wang

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引用回帖:
40楼: Originally posted by 781055707 at 2016-04-10 03:37:21
70BP还胶回收呀，那个膜会过滤掉100BP以下的条带的，连T载体吧，设计下思路看行不行，200BP以下都可能是引物二聚体。...

啊？这样啊，

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41楼2016-04-10 08:31:35
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雨落wang

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引用回帖:
39楼: Originally posted by Gao-Rui at 2016-04-09 22:08:27
问题不清楚，说的再细点。是胶回收之后嘛？

是啊，胶回收之后再跑电泳就没条带了

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42楼2016-04-10 08:32:30
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804371539

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能引物二聚体，因为在100bp以下了，回收是有效率的吧，我用的试剂盒有一步是让乙醇挥发干净，不然抑制下游反应。
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43楼2016-04-10 09:06:54
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雨落wang

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引用回帖:
43楼: Originally posted by 804371539 at 2016-04-10 09:06:54
可能引物二聚体，因为在100bp以下了，回收是有效率的吧，我用的试剂盒有一步是让乙醇挥发干净，不然抑制下游反应。

哦，谢谢啊

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44楼2016-04-10 12:02:33
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wq1727

新虫 (初入文坛)
没回收到DNA吧，
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45楼2019-03-29 21:36:36
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tan9142楼
2016-04-07 18:05   回复  
雨落wang(金币+1): 谢谢参与
springburn4楼
2016-04-07 18:05   回复  
雨落wang(金币+1): 谢谢参与
Jameskelly5楼
2016-04-07 18:23   回复  
雨落wang(金币+1): 谢谢参与
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