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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 关于对PCR产物进行胶回收的问题
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dongxu451

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于对PCR产物进行胶回收的问题 已有2人参与

最近在做质粒构建实验，需要对PCR产物进行胶回收，而且在酶切后还要再次进行胶回收。在测DNA浓度的时候，浓度还可以，但是吸收峰相比于正常情况要偏离很多，但是胶回收过程中的电泳条带很清晰，只是检测这一步发现吸收峰的偏差很大，怀疑这是导致我后续的连接实验失败的一个重要原因，有没有大神可以解决，我用的是康维世纪的琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒。
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1楼 2016-03-07 09:25:41
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dongxu451

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sunlk at 2016-03-07 14:37:31
胶回收肯定会出现这种情况，多多少少肯定会有偏离，但是不影响偏离结果。另外如果浓度大的话，有点污染无所谓

浓度的话，载体大片段浓度只有15左右，目标片段浓度大约40多，这样做连接效率高不？

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6楼2016-03-07 14:53:02
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-03-07 10:21:59
dongxu451: 金币+2, ★有帮助 2016-03-07 20:12:08
跑电泳只能看出电泳条带，所以肯定是单一的。
造成吸收峰偏移的最主要原因是回收后样品有蛋白或者盐离子污染，跑电泳是看不出来的。
您可以优化一下回收步骤，尽量去除这些杂质。
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2楼2016-03-07 09:28:44
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dongxu451

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-03-07 09:28:44
跑电泳只能看出电泳条带，所以肯定是单一的。
造成吸收峰偏移的最主要原因是回收后样品有蛋白或者盐离子污染，跑电泳是看不出来的。
您可以优化一下回收步骤，尽量去除这些杂质。

我感觉问题也是出现在回收步骤中，但是我是按照试剂盒的说明书的步骤做的，而且试剂盒中的推荐步骤我也根据自己的序列情况加以改进，实在想不出其他可以改进的地方了。步骤中说加3倍体积溶胶液，我是不是可以再多加一些？有一步除去乙醇，我一般是开盖晾10min，这步骤有必要再延长时间么？
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3楼2016-03-07 10:17:51
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dongxu451

新虫 (初入文坛)


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4楼2016-03-07 12:40:57
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