为什么从T载切下来的目的片段连接不上目的载体？
首先我的目的片段2.3kb左右、T载2kb左右、目的载体12kb左右，好不容易连接上了T载，然后测序正确。就开始从T载上面酶切目的片段（条带一小点不容易分开），应该影响不大，毕竟T载和目的载体抗性不同，之后酶切目的载体。用T4连接酶连接目的载体和目的片段，单克隆长得挺好，阳检目的片段无条带，死活连不上去。目的载体应该没有问题，因为连接另外一个0.4kb左右的目的片段已经成功（酶切位点和2.3kb的酶切位点一样）请教各位大神接下来要怎么办？自己做过的改进：
1.目的片段应该正确，因为从T载上酶切时条带正确，已经改变好几次目的片段浓度，增加过0.5倍、1倍甚至两倍
2.16度过夜酶切过12h、16h、18h，
3.之前担心还是目的片段问题、又重新做了几遍，结果一样
4.酶切位点的选择确定完全正确
这些改变的结果都是有菌落产生、阳检目的片段长度没有条带 只有引物二聚体
孩子实在是没办法了，求教各位大神！
小女子在此拜谢
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京公网安备 11010802022153号
无缝克隆的方法忽视吧 因为老板就说要用双酶切，崩:了、、
T载体骨架和目标片段太近，无法区分。连接单克隆多，很有可能是骨架载体
建议换T载体连接，或者多挑单克隆
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1、目的片的方面考虑，因与T载体大小接近，为了避免酶切后回收过程中掺入T载体，可以适当提高琼脂糖浓度（即提高凝胶条带分离度），同时增加琼脂糖凝胶的长度，增加跑胶时间，300bp的差异还是可以用凝胶分离开的，最后切胶回收目标条带。
2、目标载体方面考虑，不清楚楼主的目标载体是否是从空载体出发双酶切处理的，因为空载体进行双酶切处理，是否酶切完全是比较难以检测的，电泳也无法判断双酶切均完全（常常导致大量假阳性）。
所以我们常用的方法是用实验室已经验证OK 的其他重组载体出发进行双酶切处理，比如，你提到的已经成功构建了一个12K+400bp的重组载体，并且酶切位点还一致，那么你可以直接提取该重组载体质粒出发进行双酶切，酶切后通过电泳上是否有400bp条带来判断目标载体是否酶切完全，通过胶回收拿到酶切完全的目标载体片段。
3、连接体系方面考虑，如果按上述1、2方法获得了正确的片段与载体，那么还有一个问题要提醒的，就是胶回收后的目的条带和载体，一定要进行电泳检测，一方面确认经过胶回收确实获得了目的条带（排除胶回收过程意外导致未拿到目的片段），另一方面可以初判片段和载体的浓度差异，为连接体系浓度比提供参考。
当确认载体和片段回收都OK了，你提到了尝试增加目的条带浓度来提高连接效率，这个思路没有问题，按经验甚至可以建议你尽量多的加入你的目的基因（10倍或更高），载体微量即可，因为毕竟目的基因片段过量不会对后续阳性筛选造成太大的麻烦，虽然单菌落数会比较少，但阳性率比较高。而一旦载体过量就有可能造成一些假阳性，平板长满了菌落并不是什么好事，空载率也会很高，影响结果。
4、转化遗传操作系统考虑，不清楚楼主实验使用宿主菌是哪个菌属，但12K+2.3K的重组载体也属于比较大的重组质粒了，可能对你的转化方式及感受态要求会高一些，也是需要考虑的因素。
5、阳性克隆筛选方面考虑，看楼主的问题描述，可能是使用的菌落PCR进行的阳性筛选。对于常做分子克隆的的技术人员来讲，菌落PCR其准确性可靠性低于酶切验证和测序验证，常作为一个初筛的技术手段，换句话讲就是菌落PCR阴性不一定就代表为假阳性，毕竟PCR受影响的因素比较多，我们实验中也常常遇到菌落PCR没有条带，但是提质粒酶切验证及测序均正确的情况，后来我们基本上不使用PCR了，直接提质粒酶切验证，所以楼主可以尝试对挑选的克隆进行提质粒双酶切验证，这个应该是非常直观准确的方法。
当然，如果非要进行菌落PCR，可适当增加阳性对照和阴性对照，排除PCR过程中的意外因素干扰。
这是对整个分子克隆过程主要因素分析的，希望可以为你解决难题提供思路，祝好，