最近做重叠延伸PCR连片段，一直有非特异扩增，单独将目的基因切下再做pcr还是非特异扩增，我是三个片段连接，这个非特异好像是两端的连上了中间的片段的非特异小片段，做过很多次稀释，也做过巢式PCR，还有不断的纯化，都只是p出那条非特异，各位大神有什么建议？纯化过的片段在加引物很难P，是不是都是这样啊？图一是有目的片段的，图二是纯化后只有非特异的片段。

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