可以试试一步克隆，很方便

确定同源臂设计没问题吗，连不起来很大部分原因是你的同源臂设计不合理

实验结果阴性，考虑做阳性对照。

1. 第一个阳性对照，PCR一个短片段（500-1000bp即可），接口酶依然是ecor1和hind3，连接载体依然是petduet-1，如果能连接不成功，说明你整个酶切/连接/转化体系可能有问题。

2. 大片段连接和转化的存在效率问题，你的片段+载体都有9K多了。建议你做一个对照，3900bp的片段 连 T载体（这个长度可能会有连接效率的问题，转化效率不存在瓶颈），如果连接不成功，说明你现在的连接体系对于大片段的效率非常低。如果成功了，你的片段以后就不许需要通过PCR制备了，也会后续的步骤省力。

3. 9K的质粒，热转如果效率不高，考虑换感受态，或者电转。这个要看你自己实验室的技术了，当然也有人会告诉你，9k的质粒一点也不大。

4. 我从来都是不算连接比例的，片段绝对是超量的，就算片段自连也长不出菌，