把连接体系写上来，以及片段载体多大，浓度多大。

这个载体应该是可以做蓝白斑筛选的吧，做个蓝白斑很容易就能看出来有没有插入基因。一般白斑的插入率应该有90%，你的目的片段略大，可能会稍微低一些。确认一下这个大小是否超过了载体的上限。

不知道你的连接体系是怎样的，你的片段跟载体的大小基本差不多，所以要多加目的片段进行连接，用3：1甚至5：1的比例，加大目的片段的插入效率。没用过这个载体，也确认一下这个载体是不是能直接用来TA克隆。

至于你后来说的双酶切后进一步克隆，体系是怎样的？你的目的基因有相应的酶切位点么？

你好，可能是你的目的片段太长了。。 建议您换一下连接体系。 PMD19-T中，T4连接酶在solution I 里，好像本身连接效率就不高，况且你的片段3.6K

原因是片段太长， 3.6K要连上去很难，因为载体也差不多是这么大。考虑把3.6k扩3个小1k左右的小片段，分步连上去。需要找到重合处的唯一内切酶位点。