pMD-19T载体与目的片段的连接问题
之前计划目的基因（3.6Kb）与pMD-19T进行TA克隆连接，目的片段用primerstar高保真酶后加A连接，氨苄板生长，鉴定后发现是载体自连；后来用Taq酶PCR扩增后直接与pMD-19T载体链接，最后发现还是自连的···发现这都不行后就进行一步克隆（ClonExpressTM快速克隆技术），之前认为在载体是线性的，就直接连了，但是没有连上，氨苄平板上没长；后来用以前构建好的质粒进行双酶切后进行一步克隆，可是氨苄平板上还是没有长···各位大神，求助···
转化条件：
感受态是自己用氯化钙法做的，以前也是用它来做转化，都可以的···
热击90s后，37℃活化1h后，将转化液浓缩全部涂平板···
返回小木虫查看更多
今日热帖
京公网安备 11010802022153号
我觉得第一次做的比较好，因为第二次你没有纯化。
个人觉得是你连接体系出问题了，你可以把具体信息写下来给你看看。
热击90s后，要记得冰上5min，然后加SOC,再37度恢复培养。
连接效率太低，PCR产物要纯化
你用Taq DNA聚合酶进行PCR之后进行相应的酶切就直接连接载体了吗？
构建质粒的一般步骤：
扩增目的基因---PCR产物纯化，加17ul 洗脱液洗脱（PCR产物纯化试剂盒做）---双酶切，30或50ul 体系，纯化后的PCR产物取 10ul，载体取 3ul，37度 约3-4h---胶回收（胶回收试剂盒做），加17ul 洗脱液洗脱----连接，16度，约3-4h----转化，热激时，42度，40 s 即可----后培养，加200 ul 液体LB ，37度静止培养 1 h----取200 ul 涂氨苄。
纯化是什么意思？载体和目的片段都是跑胶回收的···热击后，我冰浴了2min，然后才活化的···
，
载体和目的片段都是跑胶回收过的，应该算是纯化了吧···
之前认为是Taq酶P出来就存在A尾，就直接连接了，发现载体自连了，后来P出来之后，又用加A试剂盒加A尾进行连接转化，鉴定后还是没连上···