你的温度太高了，一般大肠杆菌用冻存管甘油零下80度保存啊，石蜡保存的温度高了，最好在-20度。

温度保藏是占一部分原因，是不是楼主所用培养基不合适还是培养条件不合适。您用是什么培养基，培养条件是什么？是不是这块出问题了呢，

菌种保藏还是应该-80比较好

活力可能下降严重了，接种量要大些，培养时间得加长些，看到长了点时就传下一代，应该有活化起来的

温度高，时间也有点久，死马当活马医吧，多接点，培养时间再长点，长出来就赶紧转接，也可能能挽回，祝你好运！

多接点种，在37度双碟培养后，再用三角瓶摇