关于Ndei 和Hindiii，Ncoi和Hindiii对pET30a双酶切的问题！
各位专家：
好，我最近在搭建一个表达质粒，是以pET30a为材料的。主要是以Ndei 和Hindiii、Ncoi和Hindiii对其进行双酶切，不过到目前为止还没有成功双酶切。
酶切体系为：34μl质粒+1μlNco?+1μlHindШ+4μl10×buffer（1*tango），37℃，3-4h ； 30μl质粒+1μlNde?+1μlHindШ+8μl10×buffer（2*tango），37℃，3-4h
这是我进行酶切的体系，之前我只切了三个小时，但是菌落pcr的结果都是假阳性，所以我就延长了酶切时间变为过夜。这次我又进行了阴性对照，发现没有加目的片段的pET30a转化BL21后也能生长，而且长的很好。这又意味着我的酶切又失败了，想来想去也不知道原因。就想请大家给点意见，帮我分析分析！谢谢了，对了，目的片段酶切效果挺好，说明酶应该是没有问题的，就是不知道为什么对于pET30a就不能发挥作用，或者说效率很差。
[ Last edited by amisking on 2009-8-9 at 16:17 ]
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京公网安备 11010802022153号
PCR 检测确定性不如双酶切。酶切时间的确是个关键的问题，还有是不是通用的ｂｕｆｆｅｒ，一起双酶切效率可能不好。
经过重组连接后，再转化ＢＬ２１，那么连接是否已经成功？阴性对照中也生长，是不是抗生素失效，或有污染。
1、质粒纯度？
2、为什么是说多少体积质粒而不是ug呢？切之前应该定浓度
3、为何你那么肯定目的片段酶切效果很好？
与楼上同问，特别是第三点。。
你是怎么知道目的片段酶切效果很好？
你用的酶是那个公司的？NEB？？
是啊,你的质粒纯度怎么样?要是不纯最好增加体积.
阴性平板如果长很多克隆说明载体酶切效果不好，虽然你现在没有给出质粒的具体浓度，单根据一般pET系统抽质粒得到的浓度，你这酶切体系的质粒浓度太高了，太高会严重影响酶切效果，一般我50uL体系才加20uL的pET系列的质粒。
到你所用酶的公司手册上看看双酶切时要用哪一种buffet，
因为有些酶在双酶切时buffer会有所选择；同时，要看
酶切的条件是不是要在37℃，有些酶不一定需要在37℃。
酶切后的电泳结果显示酶切可以，不一定代表在连接时
就能连上，
谢谢各位的意见，我根据大家的建议再做做看，