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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于Ndei 和Hindiii，Ncoi和Hindiii对pET30a双酶切的问题！
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binweisong

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于Ndei 和Hindiii，Ncoi和Hindiii对pET30a双酶切的问题！

各位专家：
     好，我最近在搭建一个表达质粒，是以pET30a为材料的。主要是以Ndei 和Hindiii、Ncoi和Hindiii对其进行双酶切，不过到目前为止还没有成功双酶切。
酶切体系为：34μl质粒+1μlNco?+1μlHindШ+4μl10×buffer（1*tango），37℃，3-4h ； 30μl质粒+1μlNde?+1μlHindШ+8μl10×buffer（2*tango），37℃，3-4h

          这是我进行酶切的体系，之前我只切了三个小时，但是菌落pcr的结果都是假阳性，所以我就延长了酶切时间变为过夜。这次我又进行了阴性对照，发现没有加目的片段的pET30a转化BL21后也能生长，而且长的很好。这又意味着我的酶切又失败了，想来想去也不知道原因。就想请大家给点意见，帮我分析分析！谢谢了，对了，目的片段酶切效果挺好，说明酶应该是没有问题的，就是不知道为什么对于pET30a就不能发挥作用，或者说效率很差。

[ Last edited by amisking on 2009-8-9 at 16:17 ]
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1楼 2009-08-09 14:52:19
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Airare

金虫 (正式写手)

虫游天下
★ ★ ★
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司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 8-9 15:15
PCR 检测确定性不如双酶切。酶切时间的确是个关键的问题，还有是不是通用的ｂｕｆｆｅｒ，一起双酶切效率可能不好。
经过重组连接后，再转化ＢＬ２１，那么连接是否已经成功？阴性对照中也生长，是不是抗生素失效，或有污染。
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——穿越死亡之门，到我这里来，虽则梦想褪色，岁月集成的果实腐烂掉，但我是永恒的真理，你将再会见我，在你从此岸渡向彼岸的生命航程中...
2楼2009-08-09 15:12:01
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-9 16:18
1、质粒纯度？
2、为什么是说多少体积质粒而不是ug呢？切之前应该定浓度
3、为何你那么肯定目的片段酶切效果很好？
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3楼2009-08-09 15:52:09
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huanshi

银虫 (小有名气)
★ ★
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司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-9 16:42
与楼上同问，特别是第三点。。

你是怎么知道目的片段酶切效果很好？

你用的酶是那个公司的？NEB？？
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4楼2009-08-09 16:33:22
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wulei0708

银虫 (小有名气)
★
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是啊,你的质粒纯度怎么样?要是不纯最好增加体积.
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5楼2009-08-09 22:13:22
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银杏下

金虫 (小有名气)
★
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阴性平板如果长很多克隆说明载体酶切效果不好，虽然你现在没有给出质粒的具体浓度，单根据一般pET系统抽质粒得到的浓度，你这酶切体系的质粒浓度太高了，太高会严重影响酶切效果，一般我50uL体系才加20uL的pET系列的质粒。
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6楼2009-08-09 22:53:07
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greatsun

木虫 (正式写手)
★
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到你所用酶的公司手册上看看双酶切时要用哪一种buffet，

因为有些酶在双酶切时buffer会有所选择；同时，要看

酶切的条件是不是要在37℃，有些酶不一定需要在37℃。

酶切后的电泳结果显示酶切可以，不一定代表在连接时

就能连上。
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7楼2009-08-09 22:58:12
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binweisong

新虫 (初入文坛)
谢谢各位的意见，我根据大家的建议再做做看，
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8楼2009-08-10 14:25:07
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
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可以考虑将载体用SAP处理下去磷酸话，这样可能得到的克隆数目会少很多，但是阳性克隆的比例肯定会上升．
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
9楼2009-08-10 14:53:01
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