应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于Ndei 和Hindiii，Ncoi和Hindiii对pET30a双酶切的问题！
91/1返回列表
查看: 1726  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

binweisong

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于Ndei 和Hindiii，Ncoi和Hindiii对pET30a双酶切的问题！

各位专家：
     好，我最近在搭建一个表达质粒，是以pET30a为材料的。主要是以Ndei 和Hindiii、Ncoi和Hindiii对其进行双酶切，不过到目前为止还没有成功双酶切。
酶切体系为：34μl质粒+1μlNco?+1μlHindШ+4μl10×buffer（1*tango），37℃，3-4h ； 30μl质粒+1μlNde?+1μlHindШ+8μl10×buffer（2*tango），37℃，3-4h

          这是我进行酶切的体系，之前我只切了三个小时，但是菌落pcr的结果都是假阳性，所以我就延长了酶切时间变为过夜。这次我又进行了阴性对照，发现没有加目的片段的pET30a转化BL21后也能生长，而且长的很好。这又意味着我的酶切又失败了，想来想去也不知道原因。就想请大家给点意见，帮我分析分析！谢谢了，对了，目的片段酶切效果挺好，说明酶应该是没有问题的，就是不知道为什么对于pET30a就不能发挥作用，或者说效率很差。

[ Last edited by amisking on 2009-8-9 at 16:17 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2009-08-09 14:52:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Airare

金虫 (正式写手)

虫游天下
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 8-9 15:15
PCR 检测确定性不如双酶切。酶切时间的确是个关键的问题，还有是不是通用的ｂｕｆｆｅｒ，一起双酶切效率可能不好。
经过重组连接后，再转化ＢＬ２１，那么连接是否已经成功？阴性对照中也生长，是不是抗生素失效，或有污染。
赞一下(7人) 回复此楼
——穿越死亡之门，到我这里来，虽则梦想褪色，岁月集成的果实腐烂掉，但我是永恒的真理，你将再会见我，在你从此岸渡向彼岸的生命航程中...
2楼2009-08-09 15:12:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-9 16:18
1、质粒纯度？
2、为什么是说多少体积质粒而不是ug呢？切之前应该定浓度
3、为何你那么肯定目的片段酶切效果很好？
赞一下(11人) 回复此楼
3楼2009-08-09 15:52:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huanshi

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-9 16:42
与楼上同问，特别是第三点。。

你是怎么知道目的片段酶切效果很好？

你用的酶是那个公司的？NEB？？
赞一下(7人) 回复此楼
4楼2009-08-09 16:33:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wulei0708

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是啊,你的质粒纯度怎么样?要是不纯最好增加体积.
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2009-08-09 22:13:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

银杏下

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
阴性平板如果长很多克隆说明载体酶切效果不好，虽然你现在没有给出质粒的具体浓度，单根据一般pET系统抽质粒得到的浓度，你这酶切体系的质粒浓度太高了，太高会严重影响酶切效果，一般我50uL体系才加20uL的pET系列的质粒。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2009-08-09 22:53:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

greatsun

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
到你所用酶的公司手册上看看双酶切时要用哪一种buffet，

因为有些酶在双酶切时buffer会有所选择；同时，要看

酶切的条件是不是要在37℃，有些酶不一定需要在37℃。

酶切后的电泳结果显示酶切可以，不一定代表在连接时

就能连上。
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2009-08-09 22:58:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

binweisong

新虫 (初入文坛)
谢谢各位的意见，我根据大家的建议再做做看，
赞一下 回复此楼
8楼2009-08-10 14:25:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以考虑将载体用SAP处理下去磷酸话，这样可能得到的克隆数目会少很多，但是阳性克隆的比例肯定会上升．
赞一下(1人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
9楼2009-08-10 14:53:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 binweisong 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +28 医学老男孩 2026-08-13 59/2950 2026-08-15 19:38 by pztchina
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +12 archvillain 2026-08-15 21/1050 2026-08-15 19:30 by pztchina
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +12 Tide man 2026-08-10 13/650 2026-08-15 16:34 by 氺木
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +7 Ldrop2023 2026-08-13 7/350 2026-08-15 15:57 by mzhh2000
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +10 majunge000 2026-08-10 13/650 2026-08-15 12:26 by hanpeng972
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +8 布布和一二 2026-08-10 11/550 2026-08-14 14:58 by Equinoxhua
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[硕博家园] 请教兼职经验 +3 是阿文鸭 2026-08-09 3/150 2026-08-14 12:07 by HER12025
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭