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binweisong新虫 (初入文坛)
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[交流]
关于Ndei 和Hindiii，Ncoi和Hindiii对pET30a双酶切的问题！
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各位专家： 好，我最近在搭建一个表达质粒，是以pET30a为材料的。主要是以Ndei 和Hindiii、Ncoi和Hindiii对其进行双酶切，不过到目前为止还没有成功双酶切。 酶切体系为：34μl质粒+1μlNco?+1μlHindШ+4μl10×buffer（1*tango），37℃，3-4h ； 30μl质粒+1μlNde?+1μlHindШ+8μl10×buffer（2*tango），37℃，3-4h 这是我进行酶切的体系，之前我只切了三个小时，但是菌落pcr的结果都是假阳性，所以我就延长了酶切时间变为过夜。这次我又进行了阴性对照，发现没有加目的片段的pET30a转化BL21后也能生长，而且长的很好。这又意味着我的酶切又失败了，想来想去也不知道原因。就想请大家给点意见，帮我分析分析！谢谢了，对了，目的片段酶切效果挺好，说明酶应该是没有问题的，就是不知道为什么对于pET30a就不能发挥作用，或者说效率很差。 [ Last edited by amisking on 2009-8-9 at 16:17 ] |
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