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求助菌落PCR的技术流程

作者 shucaiyuanyi
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求助菌落PCR的技术流程
查了好多资料,都没有详细的技术流程,希望各位帮下忙啊 ,
在下感激不尽!!

[ Last edited by telomerase on 2007-11-13 at 11:10 ] 返回小木虫查看更多

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  • 精华评论
  • yangchang1018

    常规的大概流程是:1. 挑菌;2. 摇菌;3. 提取菌液DNA(可采用试剂盒);4. 构建PCR体系并进行PCR;5.电泳检测结果。
    具体操作在文章上都可查到,当然必要时可根据你的具体要求对实验操作进行一些更改.

    还有一种比较简便的方法就是菌落PCR(Colony PCR),优点是可不必提取基因组DNA,不必酶切鉴定,而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增,省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。
    具体方法:
    1、PCR混合物的制备
    Taq buffer(10×)                  20 ul
    dNTP(2.5 mM)                     5 ul
    Primer Forward(50 mM)      10 ul
    Primer Reverse(50 mM)     10 ul
    ddH2O                                    147 ul
    Taq(2U/ul)                            8 ul
    total                                        200 ul
    将上述溶液混匀,10 ul每管分装于200 ul PCR管中。

    2、常温下随机挑选转化板上的转化子,用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体,在LB琼脂糖平板上轻点,做一拷贝;然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下(管子做好记号,如平板上点的是1#,则管子上也标1#,以便筛选到克隆后的扩到培养),盖紧管子。

    3、将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中,按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。

    4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜,使菌落扩增;次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板,直接接种摇菌,如果早上做PCR的话,下午就可以提质粒,得到重组载体。

    注意事项:设计引物很关键。一般如果是定向克隆,用载体上的通用引物即可;如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆(如单酶切或平末端连接),一条引物用载体,一条引物用目的基因上的,这样就可以比较方便的鉴定了,而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳,同时挑取的菌体不宜太多,否则会有非特异性扩增。

    [ Last edited by yangchang1018 on 2007-11-13 at 11:30 ],

  • telomerase

    pcr鉴定菌吗?
    简单的做法,  拿一个平板,背面画出小格子,并标号.
    准备pcr反应体系,不加模版。
    挑一半菌涂板,另一半PCR。除了阳性结果,再提质粒,酶切鉴定下,然后测序!!

  • reasonspare

    兄弟,菌落PCR个人意见,
    没有什么

    第一用灭菌的牙签挑取少量的菌落
    加入PCR管,

    加入准备好的PCR反应体系
    离心就可以PCr了,

    一般使用通用引物
    退火温度高一点60-63可以jiuxing
    30循环

  • hn_zht

    请参考张洪涛在生物技术上发的文章很详细

  • shucaiyuanyi

    张洪涛在生物技术上发的文章,这个文章我怎么查不到呢,能不能告诉我题目啊,感谢啊

  • glucidum

    菌落PCR要注意的是,有些人加好样进行PCR之前喜欢离心甩一下。菌落PCR不能离心的,否则菌体沉到管底就扩增不到了。

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