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shucaiyuanyi

银虫 (小有名气)

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[交流] 求助菌落PCR的技术流程

求助菌落PCR的技术流程
查了好多资料,都没有详细的技术流程,希望各位帮下忙啊 ,
在下感激不尽!!

[ Last edited by telomerase on 2007-11-13 at 11:10 ]

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1楼 2007-11-13 11:00:23

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yangchang1018

应助: (幼儿园)
在线:
虫号: 441540

★ ★ ★
telomerase(金币+2,VIP+0):谢谢应助！！欢迎多多参与交流！！
asr(金币+1,VIP+0):thanks,辛苦了.

常规的大概流程是：1. 挑菌；2. 摇菌；3. 提取菌液DNA（可采用试剂盒）；4. 构建PCR体系并进行PCR；5.电泳检测结果。
具体操作在文章上都可查到，当然必要时可根据你的具体要求对实验操作进行一些更改.

还有一种比较简便的方法就是菌落PCR（Colony PCR），优点是可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。
具体方法：
1、PCR混合物的制备
Taq buffer（10×）                20 ul
dNTP（2.5 mM）                   5 ul
Primer Forward（50 mM）    10 ul
Primer Reverse（50 mM）    10 ul
ddH2O                                  147 ul
Taq（2U/ul）                         8 ul
total                                     200 ul
将上述溶液混匀，10 ul每管分装于200 ul PCR管中。

2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。

3、将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。

4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。

注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。

[ Last edited by yangchang1018 on 2007-11-13 at 11:30 ]