显微摄影


    显微摄影是通过显微镜来拍摄的方法。在动植物检疫工作上是科学研究、经验交流、仲裁谈判不可缺少的手段之一。

要取得良好的显微摄影效果，最重要的是要有良好的显微镜设备和良好的显微镜操作技术。

显微摄影时可以用带镜头的照相机，也可用不带镜头的照相机(但要装摄影目镜于镜筒上面)后者的使用更为普遍。显微摄影比微距摄影具有更大的物像放大比，一般由几十倍到上千倍（普通光学显微镜）。

显微摄影放大倍率可用下式计算：

B2 = B1L(mm)/250mm

式中，B1——显微镜的总放大倍数，等于物镜的倍数乘目镜的倍数。

B2——照片底片上影像的放大倍数。

L——目镜至底片的距离。

由上式可知，当底片与目镜距离为250mm时，底片上影像放大倍数与显微镜的倍数相等。

显微摄影中的正确曝光：曝光是显微摄影中的重要环节，曝光的正确与否决定着照片的质量。显微摄影时影响曝光的因素非常多，例如底片的性能，照明光源的强度和色温，照明方法，滤光片使用，物镜的孔径和倍数、物镜与摄影目镜的配合，照相机皮腔的伸长量，被摄标本的颜色和光学性质等等。难于用计算方法求得正确的曝光时间，通常采用试拍法测定。测定时先用毛玻璃对焦，观察毛玻璃面上的亮度，粗估一个曝光时间。装上有底片的暗合，关闭照明灯，将暗合抽开，开灯曝光1s；关灯，遮盖1/5的暗合，再开灯使余下的4/5干版继续曝光1s（总共2s），关灯，再关上1/5暗合，再开灯曝光2s（总共4s）；关灯，再关上1/5暗合，再开灯曝光4s（总共8s）；关灯；关上1/5暗合，再开灯将最后剩下的1/5面积底片曝光8s（总共16s），曝光完毕立即冲洗，冲洗后从深浅不同的条纹中选择反差最适当的，就是这种摄影条件下的正确曝光时间，一般试摄测定时，曝光时间多依几何级数增加，即1、2、4、8、16、32等（黑白胶卷易于冲洗）。

先进的光学显微镜均附设有全自动的摄影装置（如OLYMPUSR的PM-10AD）使用时只要按其操作指引便可获得良好的摄影效果。

显微镜数值孔径与曝光的关系（设数值孔径为0.5时曝光因素为1）

物镜的数值孔径
0.08
0.01
0.25
0.50
0.65
0.85
1.25

曝光因素近似值
40
25
4
1
2/3
1/3
1/8


显微镜倍率与曝光时间的关系（设10倍物镜曝光因素为1）

物镜放大倍数
5×
10×
15×
20×
25×
50×
75×
100×

曝光因素
40
25
4
1
2/3
1/3
1/8
  


适合显微摄影的显微镜：

1 照相目镜筒，要能承受得住显微摄影装置的重量。

2. 通过双目镜筒，要能对图象进行调焦。

3. 使用光路选择移动杆(Optical Path Selector)能将光亮调到适合标本需要的强度。

4. 物镜要有高分辩率和良好的平场象（整个圆型视场图象都在一个平面上）。

5. 载物台能够转动。

6. 聚光镜带有孔径光阑和调节光轴中心的机构。

7. 显微镜要有视场光阑。

8. 光源要保证有足够的亮度，可以按照观察和摄影的需要来调节光亮度。物镜从低倍到高倍变化时，要求光亮度都能均匀。

9. 显微镜体要有防止外界震动的能力。

10. 要备有插入滤色镜的槽口。

适合显微摄影的显微摄影装置：

1. 要有能够连接显微照相机附件的装置，如35mm照相机后背或大画面底片暗合。

2. 要能够按照摄影中需要的不同光亮条件进行光路调节。

3. 要能够对标本不同的面积进行测光（对30％面积的平均测光，或对１％面积的点测光）。

4. 要能够把照相机附件牢固地固定在显微镜上。

5. 要有色温的测定装置。

6. ISO/ASA感光度要有广泛的选择范围。

7. 要有倒易律失效补偿装置，可以进行长时间的自动曝光。

8. 要能够根据标本的具体情况，进行曝光量的调节。

9. 要能够进行手动曝光。

10. 要能装配特殊用途的装置，如拍16mm电影或35mm胶片的定时定格摄影装置。

11. 控制器内装有自动曝光锁机构。

适合显微镜摄影用的物镜与照相目镜物镜：

物镜：显微摄影需要有高分辩率、广视野平像场的物镜。长筒（Long-Barrel ，缩写LB）物镜如Splan-Apl-Chromat平像场复色差物镜，各系列。短筒(Short-barrel)物镜如Plan-Apl-Chromat平像场复消色差物镜、Plan-achromats平像场消色差物镜系列。这些物镜都是被推荐的。

照相目镜：照相目镜的作用，是为物镜的色差、象差作光学补偿，使投射到感光底片上的图象、四周与中心都尽可能在一个焦点平面上。因此，正确选用生产厂家推荐的照相目镜，是十分重的。

视场光阑的作用：视场光阑的作用，一是根据物镜的倍率给予不同直径的光束面积；二是在显微镜摄影时，起着增减影象反差的作用。当光阑扩大到一定的程度，照射到标本上的光，即会有反射与不规则的散射，造成影象反差的损失。当视场光阑收缩到取景框边缘外的时候，摄影图象的反差就会改善。

孔径光阑的使用与其功能：安装在聚光器中的光阑叫孔径光阑。它的作用是使图象的分辩率、反差和焦深处于最佳状况。这些最佳条件的取得，是以所用物镜的数值孔径来调节照明系统的数值孔径（聚光镜的数值孔径）。大多数的标本，如想得到高质量的照片，孔径光阑要调节在物镜数值孔径的 60％到80％之间。

怎样调节孔径光阑：有两种方法。

第一种，是把标本对好焦点以后，取出左边目镜，用肉眼观察镜筒，边观察物镜的后焦点平面，边用手调节孔径光阑，大小以60％－80％为宜。

第二种，是应用聚光镜上刻的数值孔径的标记。例如：用数值孔径0.25的10×物镜，如让孔径光阑缩小到80％，聚光镜上的刻度标记，应该放在0.2(0.25×80％=0.2)上。

孔径光阑的功能：如孔径光阑收缩过小，会使显微照片分辩率降低。除用特殊染色，标本又切得很薄的以外，孔径光阑的收缩不得低于物镜数值孔径的60％。

孔径光阑完全打开，照片整个反差降低。

如何选购、贮藏和使用彩色胶卷：

1. 选购彩色胶卷时，要注意的问题

(1) 彩色胶卷是高度敏感的物质，它的感光速度与彩色还原都是很容易受破坏因素（如高温和湿度）的影响。当要购买彩色胶卷时，注意别去购买那些将商品架置于阳光照射下的商品。

(2) 要选购有效时间长的彩色胶卷，包装盒上都标明使用期限。

(3) 同一型号的彩色胶卷，由于生产批号不同，彩色还原的效果不一定相同。如果要经常使用用彩色胶卷，最好一次买同一生产批号、乳剂号的产品备用，这样，在同一条件下摄影，就可以避免彩色的变化了。

(4) 注意根据需要选择彩卷的DIN数，类型（如日光型、灯光型等）。

2. 彩色胶卷如何贮藏　彩色胶卷的组成与彩色还原的基本条件与性能的变化，和它的贮藏条件有关。

彩色胶卷平常最好放在冰箱内冷藏。以防高温与湿度对它的影响。要使用时，必须在１小时前从冰箱里取出，以使达到客观存在温以后才能使用。否则，彩色片表面容易产生水气凝聚的弊病。

3. 使用彩色片时应特别注意的问题

(1) 没有必要时，不要把彩色胶卷在相机里存放过久。

(2) 已拍摄的彩色胶卷，要尽快冲洗。

(3) 虽然其他反映条件都相同，如果室温忽高，忽低，也会影响彩色胶卷的颜色还原。

(4) 不要将彩色胶卷放在有害气体（如甲醛）的环境中使用，因为它对彩色还原有不良影响，

我这有个好东东，电子显微及制样技术的电子书。我们电镜课老师的讲稿。不知道是否合适。  

http://tropicalis.berkeley.edu/h ... jection/inject.html
非常详细介绍Microinjection的操作

看看这个http://www.asrm.org/Patients/FactSheets/ICSI-Fact.pdf

http://www.infertile.com/treatmnt/treats/icsi.htm

http://www.victoriafertility.com ... sperm-injection.htm

不错，正好要用