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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 实验技术 » DH5a大肠杆菌感受态细胞
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吕稀稀子

新虫 (初入文坛)

[求助] DH5a大肠杆菌感受态细胞 已有6人参与

DH5a大肠杆菌感受态细胞 CaCl2法总是做失败， 两次过夜活化实验室保存的菌株，取3ml活化好的菌液加入300ml新鲜LB液体培养基中，摇菌3小时左右，分装50ml一管，冰浴10min,4℃，6000rpm离心10min,弃上清，用6ml 0.1mol/L cacl2-mgcl2重悬, 冰浴10min,4℃，6000rpm离心10min,弃上清，再用0.4ml 0.1mol/L cacl2重悬,0.06ml无菌甘油，使之终浓度为15%，分装为0.01ml小管， -70℃保存。
使用了6支自制的感受态，加入连接产物转化后，离心发现沉淀挺多，涂板前发现混匀的菌液是乳白色，过夜培养总是长出成片的块斑，怀疑是制作感受态失败，求解答～谢谢

DH5a大肠杆菌感受态细胞


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1楼 2015-11-29 11:48:02
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jiangronglu

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
此现象存在以下问题，1:感受态做的太好了，或者说转化率太高，可以取部分转化菌液涂板。2.有没有用液氮速冻后放于70度冰箱，这样更好。

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努力就有收获，人人都能成功
3楼2015-11-30 15:00:05
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yspain

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分装50ml之前有没有测OD值

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2楼2015-11-30 14:50:20
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吕稀稀子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yspain at 2015-11-30 14:50:20
分装50ml之前有没有测OD值

没有测过  但是目测很混浊

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4楼2015-12-03 00:03:18
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yspain

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不是目测，要在一定的OD值之内才行

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5楼2015-12-03 08:46:28
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zhuec

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

个人觉得可以直接将感受态涂在抗性板上看看制备的感受态怎样。另外看转化效率可以先用质粒做转化试一下效率。

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6楼2015-12-03 09:07:22
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吕稀稀子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yspain at 2015-12-03 08:46:28
不是目测，要在一定的OD值之内才行

好的。谢谢

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7楼2015-12-05 14:25:56
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吕稀稀子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhuec at 2015-12-03 09:07:22
个人觉得可以直接将感受态涂在抗性板上看看制备的感受态怎样。另外看转化效率可以先用质粒做转化试一下效率。

谢谢

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8楼2015-12-05 14:26:13
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2013092429

新虫 (正式写手)
666666

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9楼2015-12-05 14:30:31
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yuuri208

新虫 (初入文坛)
制备好的感受态有做正负对照吗？
就是转1 ng对照质粒和空白对照涂到对应抗性的板上那种。

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10楼2015-12-05 14:45:21
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