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xiaoblackdog

新虫 (初入文坛)

[求助] gateway bp反应求助 已有2人参与

pcr之后切胶回收，纯化过柱之后进行bp反应的，可是就是bp反应做不出来，本来pcr产物是3400bp的，ccdb是1000多么，奇怪的是bp反应之后质粒和pDONR比变小了，也就是发生是bp反应，但重组的东西不对，测序结果显示是目标产物中的一个300多的片段。我手上2个基因，都是相同的情况，简直无语了，求教有没有遇到类似情况解决的大神。真的搞的莫不找头脑了。
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1楼 2015-11-23 22:32:32
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这就是假阳性，我以前做也有这种情况，多挑菌落做PCR，提了质粒先和空载体一起跑电泳，大小不对直接pass。
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2楼2015-11-24 14:46:44
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xiaoblackdog

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-11-24 14:46:44
这就是假阳性，我以前做也有这种情况，多挑菌落做PCR，提了质粒先和空载体一起跑电泳，大小不对直接pass。

挑了很多，但每次都是这样，请问你们挑了多少么，而且同实验室做别的基因没问题
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3楼2015-11-24 18:22:03
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaoblackdog at 2015-11-24 18:22:03
挑了很多，但每次都是这样，请问你们挑了多少么，而且同实验室做别的基因没问题...

我当时片段是8k多，检测了近两百个终于晒到了。差点就放弃了。
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4楼2015-11-24 19:27:31
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xiaoblackdog

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2015-11-24 19:27:31
我当时片段是8k多，检测了近两百个终于晒到了。差点就放弃了。...

好的谢谢  请问你们都是提质粒还是 菌落之后再挑
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5楼2015-11-25 23:05:17
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院里的枣

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主的问题解决了吗，我做bp反应也遇到了类似问题，克隆30个基因的启动子，做完bp反应后，pcr验证发现假阳性特别高，基本没有，目的片段本来是差不多都是2000左右，用m13通用引物扩增，片段很多都小于500，怎么办，载体也换过试了，基因也重新克隆了，同样的问题，生无可恋了，期待楼主答复
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6楼2016-10-30 22:34:57
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院里的枣

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by stone2239 at 2015-11-24 19:27:31
我当时片段是8k多，检测了近两百个终于晒到了。差点就放弃了。...

楼主的问题解决了吗，我做bp反应也遇到了类似问题，克隆30个基因的启动子，做完bp反应后，pcr验证发现假阳性特别高，基本没有，目的片段本来是差不多都是2000左右，用m13通用引物扩增，片段很多都小于500，怎么办，载体也换过试了，基因也重新克隆了，同样的问题，生无可恋了，期待楼主答复
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7楼2016-10-30 22:37:03
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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7楼: Originally posted by 院里的枣 at 2016-10-30 22:37:03
楼主的问题解决了吗，我做bp反应也遇到了类似问题，克隆30个基因的启动子，做完bp反应后，pcr验证发现假阳性特别高，基本没有，目的片段本来是差不多都是2000左右，用m13通用引物扩增，片段很多都小于500，怎么办， ...

我的当时挑了200多个才筛到，但原因主要是插入片段过大，超过8K，不容易连，你的插入长度应该不会这么高的假阳性，不知你每个挑了多少菌落来筛？
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8楼2016-10-31 12:41:44
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院里的枣

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by stone2239 at 2016-10-31 12:41:44
我的当时挑了200多个才筛到，但原因主要是插入片段过大，超过8K，不容易连，你的插入长度应该不会这么高的假阳性，不知你每个挑了多少菌落来筛？...

三十个板子，每个挑了八个，挑出来有几个，测序说成功率太低，两百多个菌，有七八个条带差不多对的，测序也说不合适，我用attb1.attb2.扩不出来，是用特异性引物扩出来的那几个，用m13f.r.扩出来的就在500bp一下

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9楼2016-10-31 12:49:00
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 院里的枣 at 2016-10-31 12:49:00
三十个板子，每个挑了八个，挑出来有几个，测序说成功率太低，两百多个菌，有七八个条带差不多对的，测序也说不合适，我用attb1.attb2.扩不出来，是用特异性引物扩出来的那几个，用m13f.r.扩出来的就在500bp一下
...

我觉得是转化的原因，你是一次转了三十个吗？可以分批转分批检测。
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10楼2016-10-31 14:46:39
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