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xiaoblackdog

新虫 (初入文坛)

[求助] gateway bp反应求助 已有2人参与

pcr之后切胶回收,纯化过柱之后进行bp反应的,可是就是bp反应做不出来,本来pcr产物是3400bp的,ccdb是1000多么,奇怪的是bp反应之后质粒和pDONR比变小了,也就是发生是bp反应,但重组的东西不对,测序结果显示是目标产物中的一个300多的片段。我手上2个基因,都是相同的情况,简直无语了,求教有没有遇到类似情况解决的大神。真的搞的莫不找头脑了。
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这就是假阳性,我以前做也有这种情况,多挑菌落做PCR,提了质粒先和空载体一起跑电泳,大小不对直接pass。
2楼2015-11-24 14:46:44
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xiaoblackdog

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-11-24 14:46:44
这就是假阳性,我以前做也有这种情况,多挑菌落做PCR,提了质粒先和空载体一起跑电泳,大小不对直接pass。

挑了很多,但每次都是这样,请问你们挑了多少么,而且同实验室做别的基因没问题
3楼2015-11-24 18:22:03
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaoblackdog at 2015-11-24 18:22:03
挑了很多,但每次都是这样,请问你们挑了多少么,而且同实验室做别的基因没问题...

我当时片段是8k多,检测了近两百个终于晒到了。差点就放弃了。
4楼2015-11-24 19:27:31
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xiaoblackdog

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2015-11-24 19:27:31
我当时片段是8k多,检测了近两百个终于晒到了。差点就放弃了。...

好的谢谢  请问你们都是提质粒还是 菌落之后再挑
5楼2015-11-25 23:05:17
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院里的枣

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主的问题解决了吗,我做bp反应也遇到了类似问题,克隆30个基因的启动子,做完bp反应后,pcr验证发现假阳性特别高,基本没有,目的片段本来是差不多都是2000左右,用m13通用引物扩增,片段很多都小于500,怎么办,载体也换过试了,基因也重新克隆了,同样的问题,生无可恋了,期待楼主答复
6楼2016-10-30 22:34:57
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院里的枣

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2015-11-24 19:27:31
我当时片段是8k多,检测了近两百个终于晒到了。差点就放弃了。...

楼主的问题解决了吗,我做bp反应也遇到了类似问题,克隆30个基因的启动子,做完bp反应后,pcr验证发现假阳性特别高,基本没有,目的片段本来是差不多都是2000左右,用m13通用引物扩增,片段很多都小于500,怎么办,载体也换过试了,基因也重新克隆了,同样的问题,生无可恋了,期待楼主答复
7楼2016-10-30 22:37:03
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 院里的枣 at 2016-10-30 22:37:03
楼主的问题解决了吗,我做bp反应也遇到了类似问题,克隆30个基因的启动子,做完bp反应后,pcr验证发现假阳性特别高,基本没有,目的片段本来是差不多都是2000左右,用m13通用引物扩增,片段很多都小于500,怎么办, ...

我的当时挑了200多个才筛到,但原因主要是插入片段过大,超过8K,不容易连,你的插入长度应该不会这么高的假阳性,不知你每个挑了多少菌落来筛?
8楼2016-10-31 12:41:44
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院里的枣

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by stone2239 at 2016-10-31 12:41:44
我的当时挑了200多个才筛到,但原因主要是插入片段过大,超过8K,不容易连,你的插入长度应该不会这么高的假阳性,不知你每个挑了多少菌落来筛?...

三十个板子,每个挑了八个,挑出来有几个,测序说成功率太低,两百多个菌,有七八个条带差不多对的,测序也说不合适,我用attb1.attb2.扩不出来,是用特异性引物扩出来的那几个,用m13f.r.扩出来的就在500bp一下

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9楼2016-10-31 12:49:00
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 院里的枣 at 2016-10-31 12:49:00
三十个板子,每个挑了八个,挑出来有几个,测序说成功率太低,两百多个菌,有七八个条带差不多对的,测序也说不合适,我用attb1.attb2.扩不出来,是用特异性引物扩出来的那几个,用m13f.r.扩出来的就在500bp一下
...

我觉得是转化的原因,你是一次转了三十个吗?可以分批转分批检测。
10楼2016-10-31 14:46:39
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