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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » gateway BP反应 长出的单菌落 假阳性！！
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123n

木虫 (正式写手)

[交流] gateway BP反应 长出的单菌落 假阳性！！ 已有3人参与

目的片段1300bp左右！ 通过attB整合到一个载体上（利用gateway BP酶 kit），然后通过抗性平板筛选！提质粒，PCR检测均为假阳性，PCR出来的片段大约不到3000bp！！！   为何？？？求解答啊！！！！！！
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1楼 2015-04-29 18:02:12
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-05-03 14:18:34
目的片段1300左右，pcr产物不到3000？不是用目的片段的引物进行PCR反应吗，那就可能是没有连到载体上，所以扩不出来。建议1重新连接。2多挑取单菌落，菌液培养后直接菌液pcr检测，有一次我挑取50个，但检测只有3个阳性。祝成功！
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2楼2015-04-30 11:15:33
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393658000

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by 镜子的诱惑 at 2015-04-30 11:15:33
目的片段1300左右，pcr产物不到3000？不是用目的片段的引物进行PCR反应吗，那就可能是没有连到载体上，所以扩不出来。建议1重新连接。2多挑取单菌落，菌液培养后直接菌液pcr检测，有一次我挑取50个，但检测只有3个阳 ...

你这阳性率也太差了吧  50个才3个，

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2015-05-02 09:40:53
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Huobol

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用的什么载体啊，pDONR221用M13F和M13R检测，菌液PCR挺好用的，退火60℃可以的；attB-pcr条带单一的话，纯化回收比较好，25℃连接反应，多几个小时，应该很好做的。我的平板上就长两个菌，拿去测序都是正确的，幸运一些！
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让羽毛再飞一会儿
4楼2015-07-02 23:43:56
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