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123n

木虫 (正式写手)

[交流] gateway BP反应 长出的单菌落 假阳性!! 已有3人参与

目的片段1300bp左右! 通过attB整合到一个载体上(利用gateway BP酶 kit),然后通过抗性平板筛选!提质粒,PCR检测均为假阳性,PCR出来的片段大约不到3000bp!!!   为何???求解答啊!!!!!!
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镜子的诱惑

铜虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-05-03 14:18:34
目的片段1300左右,pcr产物不到3000?不是用目的片段的引物进行PCR反应吗,那就可能是没有连到载体上,所以扩不出来。建议1重新连接。2多挑取单菌落,菌液培养后直接菌液pcr检测,有一次我挑取50个,但检测只有3个阳性。祝成功!
2楼2015-04-30 11:15:33
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393658000

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by 镜子的诱惑 at 2015-04-30 11:15:33
目的片段1300左右,pcr产物不到3000?不是用目的片段的引物进行PCR反应吗,那就可能是没有连到载体上,所以扩不出来。建议1重新连接。2多挑取单菌落,菌液培养后直接菌液pcr检测,有一次我挑取50个,但检测只有3个阳 ...

你这阳性率也太差了吧  50个才3个,

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2015-05-02 09:40:53
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Huobol

至尊木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
用的什么载体啊,pDONR221用M13F和M13R检测,菌液PCR挺好用的,退火60℃可以的;attB-pcr条带单一的话,纯化回收比较好,25℃连接反应,多几个小时,应该很好做的。我的平板上就长两个菌,拿去测序都是正确的,幸运一些!
让羽毛再飞一会儿
4楼2015-07-02 23:43:56
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