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icanplay90

铜虫 (初入文坛)

[求助] gateway体系连ENtry载体

最近构建gateway体系的入门载体，体系是pcr产物2ul，vector0.5ul,盐溶液0.5ul。 之前用的时候，转化一次，虽然长的点不多，但一般都有阳性克隆。这次想连一个启动子加基因全长的片段，大约6900bp左右。反应的条件是22度30min。长了八个点，但是今天上午一鉴定，全是假阳性。。。这是为什么呀为什么？求指教问题出那了。。。
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1楼 2013-05-31 18:31:27
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starseacow

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【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-31 18:59:27
BP反应的话，你想连上的基因比较大，可以考虑使用2微升基因DNA，1微升vector（两者浓度100 ng/ul以上），再加0.5微升酶混匀，另外，22度30min太短，最好室温过夜反应。
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2楼2013-05-31 18:57:21
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icanplay90

铜虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by starseacow at 2013-05-31 18:57:21
BP反应的话，你想连上的基因比较大，可以考虑使用2微升基因DNA，1微升vector（两者浓度100 ng/ul以上），再加0.5微升酶混匀，另外，22度30min太短，最好室温过夜反应。

恩 我试一下 实验室管理的老师是个抠门 每次连ENTRY载体 就告诉我一个反应多贵多贵 总之 谢谢 等我试完了给您答复
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3楼2013-05-31 20:41:09
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starseacow

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【答案】应助回帖

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3楼: Originally posted by icanplay90 at 2013-05-31 20:41:09
恩 我试一下 实验室管理的老师是个抠门 每次连ENTRY载体 就告诉我一个反应多贵多贵 总之 谢谢 等我试完了给您答复...

Good luck！
20次152镑，但每次反应只用0.5微升，可以用到70-80次
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4楼2013-05-31 20:57:31
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icanplay90

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by starseacow at 2013-05-31 20:57:31
Good luck！
20次152镑，但每次反应只用0.5微升，可以用到70-80次...

试了一下 没连上 然后我用紫外分光光度计测了下浓度 没读出来
这样看来好像是我回收产物回融的时候弄得太稀了吧。 然后我就浓缩了一下 ，现在的浓度接近400ng/ul ，麻烦大虾帮忙算下体系。。。3Q！VECTOR和引物都按0.5ul算的话 还是能省则省吧 哎
我现在都不好意思要了 再这么下去 我都快用了一管了
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5楼2013-06-05 21:07:30
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starseacow

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【答案】应助回帖

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5楼: Originally posted by icanplay90 at 2013-06-05 21:07:30
试了一下 没连上 然后我用紫外分光光度计测了下浓度 没读出来
这样看来好像是我回收产物回融的时候弄得太稀了吧。 然后我就浓缩了一下 ，现在的浓度接近400ng/ul ，麻烦大虾帮忙算下体系。。。3Q！VECTOR和引物都 ...

1 之前所谓没连上，是指没有菌落生长么？检查一下你用的感受态细胞是否正确正常，你的产物和载体是否有正确的gateway位点，最后用的培养基抗性是否正确？
2 产物跑一下电泳吧，根据条带亮度估计浓度，体系还是用前面跟你说的那样，混匀室温过夜，用1微升转化细胞。另外，保险起见重做PCR。
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6楼2013-06-05 22:08:36
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icanplay90

铜虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by starseacow at 2013-06-05 22:08:36
1 之前所谓没连上，是指没有菌落生长么？检查一下你用的感受态细胞是否正确正常，你的产物和载体是否有正确的gateway位点，最后用的培养基抗性是否正确？
2 产物跑一下电泳吧，根据条带亮度估计浓度，体系还是用前 ...

对 没有菌落生长 感受态是实验室刚制备的。。。应该没问题 载体都是从公司里买的，产物是用phusion酶扩的，gateway的位点应该就是在上游引物5‘端加上CACC吧，抗性板是卡那抗性的，载体是卡那潮霉素双抗的，板都是一起配的，别人卡那抗性的菌落可以生长，然后PCR产物，我浓缩以后跑过电泳，加了3ul，带的亮度还可以，而且，我用PCR产物做模板扩过该片段中间的一条带，也亮度很好。我还以pcr产物为模板，上游单引物扩过一次，条件跟扩基因的时候是相同的，产生了弥散的条带，从1000左右到6800左右的大亮斑。
还有个问题，浓缩之后的浓度接近400ng/ul，用不用稀释？如果片段浓度过高会不会影响反应？
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7楼2013-06-05 23:39:10
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starseacow

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【答案】应助回帖

莫非我们讲的gateway系统不是一个东西？！做Invitrigen的gateway，attB1是引物前加ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct
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8楼2013-06-05 23:54:07
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icanplay90

铜虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by starseacow at 2013-06-05 23:54:07
莫非我们讲的gateway系统不是一个东西？！做Invitrigen的gateway，attB1是引物前加ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct

是这个啊 我说的是扩片段的时候用的上游引物啊
说明书上写的啊，5‘端CACC是它特异的识别位点啊
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9楼2013-06-06 00:06:35
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starseacow

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9楼: Originally posted by icanplay90 at 2013-06-06 00:06:35
是这个啊 我说的是扩片段的时候用的上游引物啊
说明书上写的啊，5‘端CACC是它特异的识别位点啊...

做Gateway的时候，第一步PCR扩增目的基因，引物要利用在目标基因5端和3端分别根据需要加上B识别位点，这些位点与载体P位点对应（如你加B1B2，载体上为P1P2）。
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10楼2013-06-06 03:43:20
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