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icanplay90

铜虫 (初入文坛)

[求助] gateway体系连ENtry载体

最近构建gateway体系的入门载体,体系是pcr产物2ul,vector0.5ul,盐溶液0.5ul。 之前用的时候,转化一次,虽然长的点不多,但一般都有阳性克隆。这次想连一个启动子加基因全长的片段,大约6900bp左右。反应的条件是22度30min。长了八个点,但是今天上午一鉴定,全是假阳性。。。这是为什么呀为什么?求指教问题出那了。。。
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starseacow

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感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-31 18:59:27
BP反应的话,你想连上的基因比较大,可以考虑使用2微升基因DNA,1微升vector(两者浓度100 ng/ul以上),再加0.5微升酶混匀,另外,22度30min太短,最好室温过夜反应。
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2楼2013-05-31 18:57:21
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starseacow

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3楼: Originally posted by icanplay90 at 2013-05-31 20:41:09
恩 我试一下 实验室管理的老师是个抠门 每次连ENTRY载体 就告诉我一个反应多贵多贵 总之 谢谢 等我试完了给您答复...

Good luck!
20次152镑,但每次反应只用0.5微升,可以用到70-80次
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4楼2013-05-31 20:57:31
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starseacow

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5楼: Originally posted by icanplay90 at 2013-06-05 21:07:30
试了一下 没连上 然后我用紫外分光光度计测了下浓度 没读出来
这样看来好像是我回收产物回融的时候弄得太稀了吧。 然后我就浓缩了一下 ,现在的浓度接近400ng/ul ,麻烦大虾帮忙算下体系。。。3Q!VECTOR和引物都 ...

1 之前所谓没连上,是指没有菌落生长么?检查一下你用的感受态细胞是否正确正常,你的产物和载体是否有正确的gateway位点,最后用的培养基抗性是否正确?
2 产物跑一下电泳吧,根据条带亮度估计浓度,体系还是用前面跟你说的那样,混匀室温过夜,用1微升转化细胞。另外,保险起见重做PCR。
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6楼2013-06-05 22:08:36
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starseacow

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莫非我们讲的gateway系统不是一个东西?!做Invitrigen的gateway,attB1是引物前加ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct
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8楼2013-06-05 23:54:07
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starseacow

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9楼: Originally posted by icanplay90 at 2013-06-06 00:06:35
是这个啊 我说的是扩片段的时候用的上游引物啊
说明书上写的啊,5‘端CACC是它特异的识别位点啊...

做Gateway的时候,第一步PCR扩增目的基因,引物要利用在目标基因5端和3端分别根据需要加上B识别位点,这些位点与载体P位点对应(如你加B1B2,载体上为P1P2)。
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10楼2013-06-06 03:43:20
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starseacow

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我以前分享过Gateway的说明书,不知你看的是不是这个
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4409532
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11楼2013-06-06 03:48:05
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