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icanplay90铜虫 (初入文坛)
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gateway体系连ENtry载体
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| 最近构建gateway体系的入门载体，体系是pcr产物2ul，vector0.5ul,盐溶液0.5ul。 之前用的时候，转化一次，虽然长的点不多，但一般都有阳性克隆。这次想连一个启动子加基因全长的片段，大约6900bp左右。反应的条件是22度30min。长了八个点，但是今天上午一鉴定，全是假阳性。。。这是为什么呀为什么？求指教问题出那了。。。 |
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3楼2013-05-31 20:41:09
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5楼2013-06-05 21:07:30
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对 没有菌落生长 感受态是实验室刚制备的。。。应该没问题 载体都是从公司里买的，产物是用phusion酶扩的，gateway的位点应该就是在上游引物5‘端加上CACC吧，抗性板是卡那抗性的，载体是卡那潮霉素双抗的，板都是一起配的，别人卡那抗性的菌落可以生长，然后PCR产物，我浓缩以后跑过电泳，加了3ul，带的亮度还可以，而且，我用PCR产物做模板扩过该片段中间的一条带，也亮度很好。我还以pcr产物为模板，上游单引物扩过一次，条件跟扩基因的时候是相同的，产生了弥散的条带，从1000左右到6800左右的大亮斑。 还有个问题，浓缩之后的浓度接近400ng/ul，用不用稀释？如果片段浓度过高会不会影响反应？ |
7楼2013-06-05 23:39:10
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9楼2013-06-06 00:06:35