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icanplay90

铜虫 (初入文坛)

[求助] gateway体系连ENtry载体

最近构建gateway体系的入门载体,体系是pcr产物2ul,vector0.5ul,盐溶液0.5ul。 之前用的时候,转化一次,虽然长的点不多,但一般都有阳性克隆。这次想连一个启动子加基因全长的片段,大约6900bp左右。反应的条件是22度30min。长了八个点,但是今天上午一鉴定,全是假阳性。。。这是为什么呀为什么?求指教问题出那了。。。
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starseacow

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【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by icanplay90 at 2013-06-06 00:06:35
是这个啊 我说的是扩片段的时候用的上游引物啊
说明书上写的啊,5‘端CACC是它特异的识别位点啊...

做Gateway的时候,第一步PCR扩增目的基因,引物要利用在目标基因5端和3端分别根据需要加上B识别位点,这些位点与载体P位点对应(如你加B1B2,载体上为P1P2)。
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
10楼2013-06-06 03:43:20
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-31 18:59:27
BP反应的话,你想连上的基因比较大,可以考虑使用2微升基因DNA,1微升vector(两者浓度100 ng/ul以上),再加0.5微升酶混匀,另外,22度30min太短,最好室温过夜反应。
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2楼2013-05-31 18:57:21
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icanplay90

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2013-05-31 18:57:21
BP反应的话,你想连上的基因比较大,可以考虑使用2微升基因DNA,1微升vector(两者浓度100 ng/ul以上),再加0.5微升酶混匀,另外,22度30min太短,最好室温过夜反应。

恩 我试一下 实验室管理的老师是个抠门 每次连ENTRY载体 就告诉我一个反应多贵多贵 总之 谢谢 等我试完了给您答复
3楼2013-05-31 20:41:09
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by icanplay90 at 2013-05-31 20:41:09
恩 我试一下 实验室管理的老师是个抠门 每次连ENTRY载体 就告诉我一个反应多贵多贵 总之 谢谢 等我试完了给您答复...

Good luck!
20次152镑,但每次反应只用0.5微升,可以用到70-80次
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
4楼2013-05-31 20:57:31
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