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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 模板稀释后，Ct值的问题
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O天琊O

银虫 (小有名气)

[求助] 模板稀释后，Ct值的问题 已有3人参与

我的模板，没稀释时扩增的Ct值约在22~23左右，稀释3倍后，Ct值直接后延了约5个循环，将近28了！！！这起峰太慢了，重复了几次都是这样的结果。请教各位，这是什么原因导致的，优化体系的话，除了Mg   和酶的用量外，还需要如何进行？

模板是人基因组DNA，引物0.4 uM，用的是染料法。
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没有什么不可以
1楼 2015-08-26 11:26:53
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evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-08-27 22:57:19
我不清楚你的实验目的

如果你是要扩增DNA来做克隆的话，只要有出对的条带，多做几个反应就可以了

如果你是做qPCR定量的话，Ct值28也不成问题，因为稀释后你的内参Ct也会跟着变啊？

我们实验室一般认为Ct超过32的就不怎么靠谱
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2楼2015-08-26 11:40:07
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-08-27 22:57:33
你引物做没做扩增效率？估计有可能是引物的问题。建议你把模板稀释不同梯度，做一下引物效率。从你的描述来看稀释了三倍，ct值加一左右为正常。估计是引物效率不行，建议做一个引物效率的反应，重新找对合适引物。
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hehe
3楼2015-08-26 20:10:30
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O天琊O

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by evangelina at 2015-08-26 11:40:07
我不清楚你的实验目的

如果你是要扩增DNA来做克隆的话，只要有出对的条带，多做几个反应就可以了

如果你是做qPCR定量的话，Ct值28也不成问题，因为稀释后你的内参Ct也会跟着变啊？

我们实验室一般认为Ct超 ...

我的需要检测限的，大约20ng的基因组DNA，Ct值在30左右，这可咋办呀
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没有什么不可以
4楼2015-08-27 11:27:13
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O天琊O

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2015-08-26 20:10:30
你引物做没做扩增效率？估计有可能是引物的问题。建议你把模板稀释不同梯度，做一下引物效率。从你的描述来看稀释了三倍，ct值加一左右为正常。估计是引物效率不行，建议做一个引物效率的反应，重新找对合适引物。

我做SNP扩增，引物3端倒数第三个碱基人为错配，这种情况怎么增加扩增效率呢？
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没有什么不可以
5楼2015-08-27 11:28:51
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O天琊O

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2015-08-26 20:10:30
你引物做没做扩增效率？估计有可能是引物的问题。建议你把模板稀释不同梯度，做一下引物效率。从你的描述来看稀释了三倍，ct值加一左右为正常。估计是引物效率不行，建议做一个引物效率的反应，重新找对合适引物。

增加酶的用量，提高镁离子浓度，增加引物浓度，降低退火温度？
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没有什么不可以
6楼2015-08-27 11:30:41
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什么果

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2015-08-26 20:10:30
你引物做没做扩增效率？估计有可能是引物的问题。建议你把模板稀释不同梯度，做一下引物效率。从你的描述来看稀释了三倍，ct值加一左右为正常。估计是引物效率不行，建议做一个引物效率的反应，重新找对合适引物。

请问~那是不是~在相同体系、相同引物的情况下，同一基因在不同处理条件下扩增效率不变啊
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7楼2015-08-27 22:03:13
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