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O天琊O

银虫 (小有名气)

[求助] 模板稀释后,Ct值的问题 已有3人参与

我的模板,没稀释时扩增的Ct值约在22~23左右,稀释3倍后,Ct值直接后延了约5个循环,将近28了!!!这起峰太慢了,重复了几次都是这样的结果。请教各位,这是什么原因导致的,优化体系的话,除了Mg   和酶的用量外,还需要如何进行?

模板是人基因组DNA,引物0.4 uM,用的是染料法。
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没有什么不可以
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evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-08-27 22:57:19
我不清楚你的实验目的

如果你是要扩增DNA来做克隆的话,只要有出对的条带,多做几个反应就可以了

如果你是做qPCR定量的话,Ct值28也不成问题,因为稀释后你的内参Ct也会跟着变啊?

我们实验室一般认为Ct超过32的就不怎么靠谱
2楼2015-08-26 11:40:07
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-08-27 22:57:33
你引物做没做扩增效率?估计有可能是引物的问题。建议你把模板稀释不同梯度,做一下引物效率。从你的描述来看稀释了三倍,ct值加一左右为正常。估计是引物效率不行,建议做一个引物效率的反应,重新找对合适引物。
hehe
3楼2015-08-26 20:10:30
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O天琊O

银虫 (小有名气)

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2楼: Originally posted by evangelina at 2015-08-26 11:40:07
我不清楚你的实验目的

如果你是要扩增DNA来做克隆的话,只要有出对的条带,多做几个反应就可以了

如果你是做qPCR定量的话,Ct值28也不成问题,因为稀释后你的内参Ct也会跟着变啊?

我们实验室一般认为Ct超 ...

我的需要检测限的,大约20ng的基因组DNA,Ct值在30左右,这可咋办呀
没有什么不可以
4楼2015-08-27 11:27:13
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O天琊O

银虫 (小有名气)

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3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2015-08-26 20:10:30
你引物做没做扩增效率?估计有可能是引物的问题。建议你把模板稀释不同梯度,做一下引物效率。从你的描述来看稀释了三倍,ct值加一左右为正常。估计是引物效率不行,建议做一个引物效率的反应,重新找对合适引物。

我做SNP扩增,引物3端倒数第三个碱基人为错配,这种情况怎么增加扩增效率呢?
没有什么不可以
5楼2015-08-27 11:28:51
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O天琊O

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2015-08-26 20:10:30
你引物做没做扩增效率?估计有可能是引物的问题。建议你把模板稀释不同梯度,做一下引物效率。从你的描述来看稀释了三倍,ct值加一左右为正常。估计是引物效率不行,建议做一个引物效率的反应,重新找对合适引物。

增加酶的用量,提高镁离子浓度,增加引物浓度,降低退火温度?
没有什么不可以
6楼2015-08-27 11:30:41
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什么果

新虫 (初入文坛)

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3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2015-08-26 20:10:30
你引物做没做扩增效率?估计有可能是引物的问题。建议你把模板稀释不同梯度,做一下引物效率。从你的描述来看稀释了三倍,ct值加一左右为正常。估计是引物效率不行,建议做一个引物效率的反应,重新找对合适引物。

请问~那是不是~在相同体系、相同引物的情况下,同一基因在不同处理条件下扩增效率不变啊
7楼2015-08-27 22:03:13
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