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leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate

[求助] TAQMAN探针定量PCR中的阴性样品扩增曲线问题-2

这几天看到虫友们热情讨论我上一篇帖子的问题，甚是高兴，并且觉得有必要利用此机会和大家深入探讨定量PCR的问题。之前百度、谷歌得到的答案，没有针对性。希望在此进行的讨论，能对你我他都有帮助。
我做定量PCR时，很多情况下，会遇到阴性对照在33个循环以后出现扩增的情况，SYBR和TAQMAN都有，下面分开说明。
SYBR法时，我对阴性对照溶解曲线分析后，其溶解温度并没有与模板退火温度相差10度左右，仅3-5度。而且，阳性样品的溶解曲线分析没有出现双峰。百度之后，有种说法是只要没有出现双峰，并且阴性对照单峰与阳性样品的单峰温度相差不大，可以认为不是引物二聚体，不影响实验结果。但是，这种情况到底是怎么造成的？并且随机出现，而不是一直出现。有可能是污染，但也有可能是二聚体。之所以说是二聚体，我认为，也许是引物与模板结合能力大于引物之间的结合能力，所以在有模板的情况下，引物优先与模板结合；而当只有引物时，便形成二聚体。经研究决定，既然阳性样品未出现双峰，那么抛弃32个循环以后的样品（阴性对照在33-34出现CT）。
TAQMAN法时，正如我上一篇帖子所示。因为之前师姐在做时，也经常遇到这种情况，并且将阴性对照中的扩增产物再进行PCR后，依旧是33个循环后起峰，而不是理论上早早的起峰（这是因为如果阴性样品有污染，那么高CT值便说明其量极少。但是将其再进行PCR时，上一轮的产物量作为模板已经足量，便可较早产生CT）。通过研究与分析后决定，这种情况并非污染所致，但实在找不出原因。为了避免无用的重复和慎重起见，我们决定，抛弃30个循环之后的样品，只保留前面。像这种处理方法，我曾经在一次生命技术讲座中见到过。他们的观点是，有些时候，阴性扩增出现CT的情况在所难免，为了保险起见，可以将此CT-5个循环之前的样品保留下来继续研究，其余全部抛弃。
定量PCR属于比较精密的生物研究方法，从准备到上样等等操作来不得半点闪失，对实验人员要求严格。我认为，如此费心费力的实验，进行一次已很不容易，我们一定要尽量避免无谓的反复。另外，制备标准品时，每稀释10倍便增加3.32个循环，而定量PCR的置信区间一般为8-30，有时可以到35。那么在大跨度稀释标准品时，往往低浓度的标准品便会因为上述问题惨遭抛弃，造成实验失败。因此，在此我们讨论此类问题以便找出对策，以避免将来同类问题的出现，为定量PCR实验者带去福音！
PS：有一个很重要的问题，困扰了我很久：定量PCR的反应步骤必须是固定的吗？是不是至多可以改改退火温度？循环次数能不能改？反应时间呢？我用的是ABI 7500，默认值一直都是40个循环。我想，既然上述问题是在35起峰，那么干脆设置循环数为35不就行了？这样做，无非是想做出一张好图。如果审稿专家、答辩专家能理解咱们出现的问题，还要这张好图干嘛？对不对？
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不忘初心，为梦远行。
1楼 2011-06-09 10:11:11
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Explor
2楼2019-11-04 14:12:58
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