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zhoujiang09

新虫 (初入文坛)

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[交流] 荧光定量PCR的实验思路（求助）已有1人参与

各位师兄师姐，我想请教一下荧光定量PCR的实验思路，我之前把RNA提了出来，并逆转录成cDNA了，并做了普通PCR。现在我要开始做荧光定量PCR了，可是我不怎么会，我做的是相对定量（2-deltadelta Ct 法），请师兄师姐们帮帮我。我听有些人说先要拿模板（cDNA）上机摸索退火温度，再拿ct值最小的那个作为标准品，适当的倍数稀释成5个梯度，再做标准曲线，最后上样品和标准曲线对照，是这样吗？

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1楼 2012-04-15 21:12:27

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孙启亮

金虫 (著名写手)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 专家考核, 专业解答， 2012-04-16 13:39:00

你首先得买荧光，不要买多，因为现在你还不知道哪个公司的荧光更适合你的目的基因。具体的结果还得等你做扩增效率的时候才知道。建议直接做荧光，不做普通的，这样节省时间同时也不会比先做普通PCR节省多少钱。
其次，摸索实验条件一般都是摸索退火温度，你可以根据自己设计的引物大致确定你的退火温度在什么范围，然后做荧光，跑胶，根据扩增曲线与跑胶条带灰度值等综合指标选定一个合适的退火温度。
再次，合适的Ct值范围应该是18-30，最好在23-24左右。但是有时候15以上，32以下也是可以接受的，这主要和你的目的基因有关。一般会出现的情况是Ct值太高，但如果你的目的基因拷贝数太低，那Ct值肯定高。
最后，关于扩增效率，扩增效率的制作不需要对照，你的目的就是做引物的扩增效率，看这个引物能不能被你所用。目的基因和内参都得做，扩增效率直接影响到你的定量计算公式是否适用。只有在扩增效率在90%-105%的时候，才能用你说的那种方法。但有时候120%以下的扩增效率也可以接受。扩增效率的制作是通过倍比稀释法，做六个梯度。
祝楼主实验顺利

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