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小叶子92

铁虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 3248762
注册: 2014-06-02
专业: 昆虫学

[求助] 求助做过miRNA功能分析的大神们，如何对一个未知功能的新的miRNA进行分析？

额。。刚入门的小白，我要做的是昆虫中的miR-927a，但是查了之后发现没有人做过功能研究，在其他物种中也没有人做过，没法参考。。像这种miRNA,我该如何着手做呢？
我现在有一个大致的步骤：1 对这个miRNA进行靶基因预测，
                                       2 进行qrt-PCR分析miRNA表达量，
                                       3 进行靶基因3‘UTR荧光素酶告基因的检测
         我现在的问题是：我要做的是对miRNA 的功能进行验证，是否需要进行miRNA mimics或inhibitor的处理？如果需要这一步的话是在荧光素酶检测之前还是之后？但是用模拟物处理的话好像还需要知道作用的靶基因才行，如果需要知道靶基因的功能，是否需要进行GO通路分析?
            现在最大的问题就是是否需要进行GO通路分析来确定靶基因，还有就是希望能帮我看看我的步骤是否需要完善.
谢谢大家！！！

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1楼 2015-07-07 14:50:57

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央宗兰泽

新虫 (初入文坛)

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虫号: 4202670
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专业: 动物遗传学

双荧光素酶报告基因实验是通过将预测能够与miRNA结合的靶基因3’UTR序列插入载体中萤火虫荧光蛋白（firefly luciferase）的3’UTR。当我们感兴趣的miRNA和质粒中的插入序列结合后，miRNA会通过和所插入的序列结合从而抑制萤火虫荧光蛋白的翻译最终造成荧光值的下降。海肾素荧光蛋白（renilla luciferase）是作为内参来去除组间的转染效率差异的。其实你也可以理解为：用荧光值来判断miRNA是否和靶基因结合。
1、在了解原理后我们来看一下要做一次荧光素酶报告实验需要哪些东西：
1. 细胞
许多同学固执的一定要选用目的细胞来做实验，其实我们本来就是要验证分子间的相互作用，细胞只是一个媒介或载体，选用工具细胞如293T、HEK293等即可。选择工具细胞的条件总结如下：
1）好转染、且转染效率较高
2）目的microRNA的表达水平极低或不表达
2. 质粒
首先我们需要萤火虫荧光素酶3’UTR插入目的序列的载体，通常我们管它叫野生型质粒。这里要注意哦，不一定要插入靶基因的3’UTR全长。可以只插入包括miRNA结合位点前后200bp左右的序列。有的基因3’UTR有几千到上万bp。
其次我们需要萤火虫荧光素酶3’UTR插入miRNA结合位点突变的序列载体，这个短语好长啊，请各位同学看清里面的定语。通常管它叫突变型质粒。这个质粒是整个实验中至关重要的一部分。你能不能发现分子间的直接相互作用就靠它了。
当然，我们需要miRNA的过表达载体。这个不用多说了吧，没有miRNA怎么做实验呢。
最后也不能少了各种对照载体啊，包括萤火虫荧光素酶空载体，miRNA空载体还有海肾素荧光载体。

　