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yuehedou

木虫 (小有名气)

[求助] miRNA差异表达分析时reads数目的校准（TPM）问题

在做miRNA的差异表达分析时，很多文章里都要使用TPM（Transcripts per million，公式为：单一miRNA reads数×10^6/总reads数）来校准miRNA的表达量，这样做是为了去除pcr扩增文库时的偏倚吗？
然后，如果使用TPM进行校准，那也会产生另外的差异啊我觉得，举个极端的例子：样品A中实际总共表达了10个reads，其中miR1表达了2个；样品B总共表达了100个reads，其中miR1表达了20个，——实际上在两个样品中miR1是显著差异表达的，但经TPM校准后，两个样品中其表达量就都成了20 000，就一样了么，那么校准岂不是产生了原来没有的错误？？
我觉得miRNA是短序列，不存在转录组中序列片段长短的问题，那么直接使用reads的count作为其相应miRNA的表达量岂不是更好？
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1楼 2014-05-05 15:44:11
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myibm369

木虫 (正式写手)

~~~~~~~~~~~~~~~~~

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yuehedou: 金币+18, ★★★★★最佳答案, 非常给力！ 2014-05-06 15:10:14
引用回帖:
使用TPM（Transcripts per million，公式为：单一miRNA reads数×10^6/总reads数）来校准miRNA的表达量

这其实是个normalization的过程，因为假如你有多个样品（》=2），测序得到的total mapping reads的数目是不一样的，大家必须normalize到同一个水平才方便比较。
引用回帖:
样品A中实际总共表达了10个reads，其中miR1表达了2个；样品B总共表达了100个reads，其中miR1表达了20个

你说的实际应该是指细胞内真正表达的数量吧，但是实际上通过测序你是拿不到真正意义上的绝对表达量，只是一个相对的表达量。我们在进行2个或者多个样品genes或者miRNA表达差异分析比较的时候，是默认总体RNA表达的一样多的。简单来说就是你例子中sample A和B的RNA总量是一致的，不过A测序测到了10个reads，B测序测的比较多，拿到了100个reads，如果A也达到B的测序深度，其实miR1也就是20个reads，表达量是一致的。

不知道你明白否
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2楼2014-05-06 09:24:15
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yuehedou

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by myibm369 at 2014-05-06 09:24:15
这其实是个normalization的过程，因为假如你有多个样品（》=2），测序得到的total mapping reads的数目是不一样的，大家必须normalize到同一个水平才方便比较。


你说的实际应该是指细胞内真正表达的数量吧， ...

引用回帖:
这其实是个normalization的过程，因为假如你有多个样……

我觉得total mapping reads的数目不一样才是正常的，因为是不同样品。
引用回帖:
你说的实际应该是指细胞内真正表达的数量吧……

我说的是实际表达量。我认为只要能控制建库均匀度、测序深度，那得到的数据反映的应该就是实际表达丰度，即使这种反映是将原来的表达量以一种集体相对的方式表现出来，例如将实际的表达量整体放大。因为实际总体和单个的表达量就不一致，在测序深度同样为10的情况下，样品A中miR1表达了1，放大10倍就测得了10；B中miR1表达了10，放大10倍就成了100. 那我们后边又进行校准，就人为地抹掉了这种差异——实际上它们却是有显著差异的。
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3楼2014-05-06 11:53:03
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myibm369

木虫 (正式写手)

~~~~~~~~~~~~~~~~~
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuehedou at 2014-05-06 11:53:03
我觉得total mapping reads的数目不一样才是正常的，因为是不同样品。

我说的是实际表达量。我认为只要能控制建库均匀度、测序深度，那得到的数据反映的应该就是实际表达丰度，即使这种反映是将原来的表达量以 ...

其实你假设下就知道了，上机测序的total miRNA量 A为10ng其中miR1有1ng，B为10ng其中miRNA1有0.1ng，那么你最后测序得到的结果比例还是这样的，A中miR1为10%，B中miR1为1%，都normalization到100，那么A的miR1是10，B的是1。
<quote>在测序深度同样为10的情况下，样品A中miR1表达了1，放大10倍就测得了10；B中miR1表达了10，放大10倍就成了100. 那我们后边又进行校准，就人为地抹掉了这种差异——实际上它们却是有显著差异的。</quote>
校准还是10：100哦，是有差异的啊。
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4楼2014-05-06 12:13:49
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yuehedou

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by myibm369 at 2014-05-06 12:13:49
其实你假设下就知道了，上机测序的total miRNA量 A为10ng其中miR1有1ng，B为10ng其中miRNA1有0.1ng，那么你最后测序得到的结果比例还是这样的，A中miR1为10%，B中miR1为1%，都normalization到100，那么A的miR1是10 ...

哦，明白了，“拿去上机测序的样品总量是一样的”，所以后边才把测得的总量校准到一样！
谢谢你的耐心讲解，终于解了心里纠结很久的困惑！
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5楼2014-05-06 15:09:26
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wangjiying

铁虫 (小有名气)
请问TMP校正公式中总reads数是指的什么？是测序产生的总Read数？还是检测出的miRNA的raw read的总和？还是其它？请指教，谢谢！
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6楼2015-08-19 00:44:37
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yuehedou

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wangjiying at 2015-08-19 00:44:37
请问TMP校正公式中总reads数是指的什么？是测序产生的总Read数？还是检测出的miRNA的raw read的总和？还是其它？请指教，谢谢！

应该是指单个样品的clean reads的总数。
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7楼2015-08-20 16:05:04
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