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jaxb银虫 (正式写手)
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[交流]
Illumina高通量RNA测序数据分析中不同标准化方法的综合比较 已有6人参与
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无论是对于芯片数据还是测序数据，数据的标准化都是基因表达分析中必备的步骤。近3年来RNA测序数据标准化的方法出现很多，但是却没有研究比较那种标准化方法效果更好。因此，Marie-Agne'sDillies等利用人、鼠、曲霉菌和线虫的illumina测序数据和一个模拟数据，比较了TC,UQ,Med,DESeq,TMM,Q,RPKM等七种方法对mRNA和miRNA数据标准化的效果。基于DESeq和TSPM方法的差异表达分析结果，该研究比较了七种标准化后数据的质量，标准化对差异表达分析结果的影响，以及差异表法分析的假阳性率和效力。结果表明，五种基于reads长度分布来校正的标准化方法（TC,UQ,Med,Q,RPKM）都增加了假阳性率，而两种基于总reads数校正的方法（DESeq,TMM）控制了假阳性率且保持了差异表达基因的检测效力。在四个真实数据上分析表明，TC,RPKM两种方法基本可以确定无效，可以抛弃。Q由于其对reads分布的假设要求很高，可能会导致组内的变异增大，也应该舍弃。UQ,Med,DESeq,TMM方法就标准化后数据的质量、差异表达分析的结果来看表现差异不大。利用模拟数据进一步分析发现，DESeq和TMM方法可以在不损失检测效率的情况下控制假阳性率。另外，这些方法都基于大部分基因是不存在表达差异这一假设，因此在实际分析中差异表达基因可能会有一定的偏差。因此作者提出可以采取多步骤标准化的策略，即TMM估计标准化因子时先把潜在的差异表达基因去掉。该研究首次比较了多个测序数据标准化方法，为RNA-seq分析中标准化的方法选择提供了一个有力的参考。 交流： 1，文中说不采用edgeR软件包进行表达差异分析，是因为它需要假设read数的分布，这个与前文是不是矛盾？ 2，后面提到的先把潜在表达基因去掉再计算标准化因子，是否是要先标准化，计算出差异表达基因，然后再去掉，再计算标准化因子，再标准化。我们的目的就是计算差异表达基因，这样一来会不会造成更大的偏差？ 3，为什么差异表达基因分析时一般都要采用负二项分布的假设？ 4，数据分为3组，每组间又分为不同的等级。这样的数据结构怎么进行比较呢？ 5，还看到一篇文献，讲的是目前的标准化方法都不好，需要发现新的方法，可是又没有给出新的方法法（miRNA-Seq normalization comparisons need improvement）。真愁人！ 文献来源：Marie-Agne'sDillies, AndreaRau, JulieAubert, et al. A comprehensive evaluation of normalization methods for Illumina high-throughput RNA sequencing data analysis. Brief Bioinform, 2013 , 14(6):671-83. |
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 高通量测序 |
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看文献的时候看到这段，关于RNA 的，我没读懂。请教各位大牛，这是什么意思啊？只言片语各种指导都非常欢迎啊！ Raw FASTQ files were demultiplexed using the FASTX-Toolkit (http://hannonlab. cshl.edu/fastx_toolkit/) and processed to contain only the unique sgRNA sequence. To align the processed reads to the library, the designed sgRNA sequences from the library were assembled into a Burrows-Wheeler index using the Bowtie build-index function. Reads were then aligned to the index using the Bowtie aligner. After alignment, the number of uniquely aligned reads for each library sequence was calculated. |
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