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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 植物miRNA干扰载体构建的大体流程
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Lopick

新虫 (初入文坛)

[求助] 植物miRNA干扰载体构建的大体流程 已有2人参与

各位大神，帮忙介绍一下植物miRNA干扰载体构建的大体流程，急求..............................
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1楼 2014-07-29 17:12:25
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2014-07-30 00:59:06
Lopick: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-07-30 10:29:20
Lopick: 金币+1 2014-08-24 16:38:13
1. 确定并合成你所要用的miRNA序列

2. 选择适当的植物病毒载体（一般慢病毒的感染效率会比较高），载体最好带有抗性基因/标记基因以便你在感染植物细胞以后可以进行筛选感染成功的细胞

3. 将miRNA克隆到病毒载体中，和普通的克隆方法是一样的，提取病毒质粒

4. 选择你的病毒载体相应的packaging cell line，转染packaging cells

5. 收集病毒上清液，浓缩病毒颗粒，就可以用来感染植物细胞了

6. 感染植物细胞以后，可以通过抗性基因来筛选感染成功的细胞，也可以通过标记基因(如荧光标记GFP)用流式来筛选感染成功的细胞
赞一下(1人) 回复此楼
下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
2楼2014-07-29 19:40:41
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Lopick

新虫 (初入文坛)
.
3楼2014-07-31 17:52:37
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-08-24 20:12:12
1.获得你的目的序列。   载体的话，不同实验有不同载体，看你老板让你用哪一个。 一般有基因枪的载体和农杆菌的载体。分析目的序列和载体的酶切位点等等，为下一步做准备。一般农杆菌转化好做，效率高。
2.把目的序列扩增（这里有点麻烦，因为RNAi不好扩增，建议酶切或者走中间载体的路），连到目的载体，转化鉴定测序。
3.得到质粒，打基因枪或者农杆菌侵染植物。
4.等植物生长，鉴定植物是否转入。
5.。。。。。。。一步一步往下做。
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4楼2014-08-01 10:23:59
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Lopick

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-29 19:40:41
1. 确定并合成你所要用的miRNA序列

2. 选择适当的植物病毒载体（一般慢病毒的感染效率会比较高），载体最好带有抗性基因/标记基因以便你在感染植物细胞以后可以进行筛选感染成功的细胞

3. 将miRNA克隆到病毒载 ...

师兄，植物的miRNA干扰载体你做过吗？
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5楼2014-08-24 16:39:37
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木欣欣60

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Lopick at 2014-08-24 16:39:37
师兄，植物的miRNA干扰载体你做过吗？...

前辈，你现在做了植物的miRNA干扰载体构建了吗？我也一直找不到具体的实验技术手段，听说miRNA sponge效果不错，你现在解决了吗？求前辈赐教！
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顺顺利利做实验，高高兴兴搞科研，幸幸福福地毕业。
6楼2015-03-27 15:26:16
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