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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量扩增曲线存在的问题
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秋天不下雪

木虫 (著名写手)

[求助] 荧光定量扩增曲线存在的问题 已有1人参与

本人是分子生物实验方面的新手，最近在做荧光定量，在做扩增曲线的时候，用10倍稀释来做，总共四个梯度，刚做的时候选择的引物退火温度是60度，发现稀释梯度之间的循环数变化达不到3.3，有时候只变大一个循环，有时候先变大有变小，极其不规律，后来把退火温度提高到 65度，情况也不容乐观，有的引物越稀释ct值越低，有的没变化，连内参的ct值跨度都不是3.3了，变成4以上了，难道是因为存在抑制物？求各位大神帮忙解答一下，不胜感激！！！
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要想做总有办法，不想做总有理由
1楼 2015-06-02 15:25:29
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lansong9783

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
秋天不下雪: 金币+10 2015-06-03 21:23:03
10倍稀释是用来看扩增效率的，影响因素很多，引物，温度，酶等。建议你做个退火温度梯度来寻找最佳扩增效率的温度。超过4可能是你引物，模板配比的问题。
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2楼2015-06-03 00:48:00
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秋天不下雪

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lansong9783 at 2015-06-03 00:48:00
10倍稀释是用来看扩增效率的，影响因素很多，引物，温度，酶等。建议你做个退火温度梯度来寻找最佳扩增效率的温度。超过4可能是你引物，模板配比的问题。

今天又做了一遍，有的基因随稀释倍数的加大，起跳得变早，可以差3个循环左右，有的基因稀释倍数之间没有差异，有的基因差距就在1左右，同一次定量就可以出现各种结果，是不是我的引物最大的扩增效率所需的退火温度不一样呀，如果不一样我应该采用不同的温度还是说各基因之间要保持一致呢，问题比较多希望能给我指点一下迷津
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要想做总有办法，不想做总有理由
3楼2015-06-03 21:22:42
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lansong9783

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 秋天不下雪 at 2015-06-03 07:22:42
今天又做了一遍，有的基因随稀释倍数的加大，起跳得变早，可以差3个循环左右，有的基因稀释倍数之间没有差异，有的基因差距就在1左右，同一次定量就可以出现各种结果，是不是我的引物最大的扩增效率所需的退火温度 ...

不同基因的最佳扩增效率的退火温度是不同的。你可以采取温度梯度来扩增
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4楼2015-06-04 02:09:25
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秋天不下雪

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lansong9783 at 2015-06-04 02:09:25
不同基因的最佳扩增效率的退火温度是不同的。你可以采取温度梯度来扩增...

恩，今天打算做温度梯度，试一试
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要想做总有办法，不想做总有理由
5楼2015-06-04 09:47:05
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