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863813707

新虫 (小有名气)

[求助] 请教各位有pcr经验的,本人梯度pcr一直没结果 已有1人参与

论文设计做抗性基因克隆,根据抗性蛋白得测序数据,自己设计引物序列,送公司合成,引物的tm值都在60-65之间,但是退火的温度梯度从65-55,60-50,55-45都做过梯度了,就是p不出来,和我一起做克隆的同学,我们除了模板和引物不一样,都一样,他的pcr是我带着一起的,可是我把他的p出来了,自己的p不出来,模板放在一起做对照跑胶,有条带,引物设计的数据,我自己检查很多遍,又让我那个同学从头到尾从原始数据帮我整理一遍,结果设计的引物和我自己弄的是一样的,那么引物序列是没有问题的,他的也是一样的方法,只不过菌不一样。跑胶时,可以看到引物也有引物二聚体。想请有经验的大牛帮忙分析分析,哪里还有问题,或者有什么可解决,或者检验的方法!毕业在即,人家写论文,我的实验结果还没出,哭死!

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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2015-05-20 10:13:08
模板没问题,一般不会是模版问题。引物还是要检查,梯度后还是没有,就要看看序列的特性。比如说GC含量,再看看你目的片段的GC含量。高GC含量可能需要选择合适的酶BUFFER,或者换酶再试试。祝顺利

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

2楼2015-05-19 21:46:10
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863813707

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-05-19 21:46:10
模板没问题,一般不会是模版问题。引物还是要检查,梯度后还是没有,就要看看序列的特性。比如说GC含量,再看看你目的片段的GC含量。高GC含量可能需要选择合适的酶BUFFER,或者换酶再试试。祝顺利

嗯嗯,谢谢,我会根据建议再试试看,整理一下,分析分析

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-05-20 00:46:23
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