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去哪里看海

铁虫 (小有名气)

[求助] 各位，最近刚刚接触绿色荧光蛋白GFP，熟悉GFP蛋白的大神们，请求帮助。 已有3人参与

看到了关于GFP蛋白的各种应用，我想用它来做基因表达的定位，大概的思路是这样子的，请大家指教。
从NCBI上面查取GFP序列，用加有合适酶切位点的引物进行PCR扩增片段，连接到质粒，再连上自己要定位的基因，化转到酵母。
目前大致是这么想的，请问这种做法可取吗？GFP基因的模板从哪里买的到？拜托大家了
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1楼 2015-05-08 15:46:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

小小cool

金虫 (正式写手)
我有gfp的模板，可以联系我哈2755157061

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2015-05-09 07:56:39
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caihang

铜虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-09 22:39:20
引用回帖:
4楼: Originally posted by 去哪里看海 at 2015-05-09 11:07:04
我找到连有GFP的质粒了，想请问一下，我是不是只要把目的基因和启动子简单连上就可以？我的目的基因是个小亚基。...

要看你的质粒是什么类型了，有的GFP在多克隆位点前面，有的在后面。有的需要自己添加启动子，有的不用。所以，你需要对照质粒的产品说明书看看。
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8楼2015-05-09 21:27:49
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普通回帖

caihang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-05-09 12:49:36
没做过酵母，只做过动物细胞。现在很多真核质粒上有GFP基因，另外，不只是GFP，还有其他的一些荧光蛋白，你也可以查查。
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2楼2015-05-08 22:40:06
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去哪里看海

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by caihang at 2015-05-08 22:40:06
没做过酵母，只做过动物细胞。现在很多真核质粒上有GFP基因，另外，不只是GFP，还有其他的一些荧光蛋白，你也可以查查。

我找到连有GFP的质粒了，想请问一下，我是不是只要把目的基因和启动子简单连上就可以？我的目的基因是个小亚基。
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4楼2015-05-09 11:07:04
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去哪里看海

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小小cool at 2015-05-09 07:56:39
我有gfp的模板，可以联系我哈2755157061

已经找到了，谢谢您。
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5楼2015-05-09 11:07:18
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jacobbai

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-05-09 12:49:46
这样，其实很简单，现在很多载体质粒都有GFP，然后你在载体上找到合适的表达位点把目的基因给弄进去就行了。然后在做转染，看表达。
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6楼2015-05-09 11:15:26
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小小cool

金虫 (正式写手)
是啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2015-05-09 20:41:17
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去哪里看海

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by caihang at 2015-05-09 21:27:49
要看你的质粒是什么类型了，有的GFP在多克隆位点前面，有的在后面。有的需要自己添加启动子，有的不用。所以，你需要对照质粒的产品说明书看看。...

谢谢您了，我再研究研究说明书，有不明白的会再请教您。
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9楼2015-05-11 08:11:40
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zeroon

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

个人觉得楼主得确定这个GFP在酵母里是否能直接使用，就是说密码子优化过没有。当然，在酵母中用的GPF很常见，ncbi上的序列带的参考文献也会提到该序列是否在酵母中应用的。

另外，细胞内某基因的定位，我估计楼主的意识是该基因编码的蛋白的定位吧？如果是这个，那么很明显，楼主需要把gfp直接连接在那个基因后，而不是单独加启动子。不然的话，你的gpf单独表达了，怎么能定位要做的那个基因的蛋白呢？
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10楼2015-05-12 18:50:45
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