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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于细胞内蛋白定位的问题，和融合蛋白表达的问题，融合PCR问题
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zeroon

木虫 (正式写手)

[求助] 关于细胞内蛋白定位的问题，和融合蛋白表达的问题，融合PCR问题 已有1人参与

背景：
现在有大约4500 bp大小的一个基因，其表达的蛋白需要在细胞内定位，初步的研究方案是在体外设计融合蛋白表达载体。即先在体外扩增该基因和绿色荧光蛋白gfp基因，然后采用融合PCR的方式将这两段基因融合在一起。当然还要在后面加抗性筛选标记。最后通过同源双交换定点整合到原来该基因的位置。最后表达基因。观察。


问题1：请问在克隆该基因时一定要去掉内含子吗？

问题2：融合时是不是要把该基因的终止子去掉，直接加上荧光蛋白基因？

问题3：因为蛋白后面加了一段荧光蛋白，会对原有的蛋白表达产生影响吗？这样做胞内定位合适吗？有没有其他更好的方法？

问题4：融合PCR过程出现了些问题，两片段融合，而且4条引物都是顶着头儿设计的，所以出现好多杂带，怎么办呢？


问题比较多，希望能和大家充分讨论，在此先谢谢各位！
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1楼 2015-03-08 11:56:25
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starseacow

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zeroon: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2015-03-09 22:50:09
1 要去掉
2 是的，去掉终止子脸上GFP
3 表达影响不大，但也许会影响表达位置，不过这也是比较通用的方法了。同时，GFP连在N或C端，要进行具体分析。
4 优化PCR体系和退火温度
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2楼2015-03-08 21:10:02
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zeroon

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by starseacow at 2015-03-08 21:10:02
1 要去掉
2 是的，去掉终止子脸上GFP
3 表达影响不大，但也许会影响表达位置，不过这也是比较通用的方法了。同时，GFP连在N或C端，要进行具体分析。
4 优化PCR体系和退火温度

非常感谢。还有些问题不够明白。
1.为什么一定要去掉内含子呢？这是一株真菌，从真菌里面来的基因，连上gfp后再放回去。都是它自己的基因，还要去内含子？
3、gfp连在N端和C端是怎么弄的，如同2中表述的，把基因终止子去掉，直接加gfp基因这种连法，是N端还是C端呢？我这里不是很明白。
4、我再尝试一下吧。感觉好难。已经尝试了很久了。不同的Tm和引物、模板浓度。
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3楼2015-03-09 22:54:42
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starseacow

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★ ★ ★
zeroon(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2015-03-11 20:35:25
引用回帖:
3楼: Originally posted by zeroon at 2015-03-09 22:54:42
非常感谢。还有些问题不够明白。
1.为什么一定要去掉内含子呢？这是一株真菌，从真菌里面来的基因，连上gfp后再放回去。都是它自己的基因，还要去内含子？
3、gfp连在N端和C端是怎么弄的，如同2中表述的，把基因 ...

1 你讲该基因在质粒上一些常见启动子下表达，并没有把这个基因正确的导入基因组，包含内含子的话，你无法确保该基因被正确表达。
2 你可以设计载体，留下合适的酶切链接位点或用gateway之类的系统，将GFP连在N端或C端。去掉终止子加GFP是C端。
3 一般设个温度梯度P一次就了解大概情况了，如果始终出不来好结果，就得考虑重新设计片段起止位置和引物。
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4楼2015-03-09 23:01:36
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zeroon

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by starseacow at 2015-03-09 23:01:36
1 你讲该基因在质粒上一些常见启动子下表达，并没有把这个基因正确的导入基因组，包含内含子的话，你无法确保该基因被正确表达。
2 你可以设计载体，留下合适的酶切链接位点或用gateway之类的系统，将GFP连在N端或 ...

因为是通过同源双交换，定点整合到这个基因原有的位置的，所以我没提到质粒上启动子什么的东西啊。想着同源双交换上去后，用的就是原有的系统中的启动子一类的。

关于连N段和C端，为什么有的要连N，有的连C呢，这块儿是一点儿都不懂，求科普，谢谢！
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5楼2015-03-11 11:33:28
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starseacow

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引用回帖:
5楼: Originally posted by zeroon at 2015-03-11 11:33:28
因为是通过同源双交换，定点整合到这个基因原有的位置的，所以我没提到质粒上启动子什么的东西啊。想着同源双交换上去后，用的就是原有的系统中的启动子一类的。

关于连N段和C端，为什么有的要连N，有的连C呢， ...

最简单的考虑，GFP只有在细胞质里才能产生荧光，你要是在做膜蛋白，有一端伸到细胞外，就不能把荧光蛋白放在那。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2015-03-11 14:44:09
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