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Red重组的引物设计问题 已有1人参与
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我完全按照文献的敲除引物序列，用Red重组进行敲除大肠杆菌ClpP基因，引物设计如下： 上游引物：50bp的基因上游同源序列+20bp的pKD3配对序列 下游引物：50bp的基因下游同原序列+20bp的pKD3配对序列 此方法敲除成功了。 但是我用相同的策略敲除DnaK基因的时候却无论如何也筛不到交换菌株（即DnaK基因被氯霉素基因替换掉的）。用的是跟上面相同的pKD3配对序列，只是把前面50bp换成DnaK的上下游同源序列，实验方法与敲除ClpP基因时是完全一样的，可是就是敲除不掉。 我想请教一下，这样的情况最可能是什么原因呢？是不是因为50bp同源臂，那么应该怎么设计同源臂的序列？我之前设计的50bp同源臂能够保证它与DnaK基因上下游的序列同源，但是没有考虑GC含量之类的其他条件，会有些什么因素影响引物设计呢？ |
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