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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » Red重组的引物设计问题
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emma的小胖

新虫 (初入文坛)

[求助] Red重组的引物设计问题 已有1人参与

我完全按照文献的敲除引物序列，用Red重组进行敲除大肠杆菌ClpP基因，引物设计如下：
上游引物：50bp的基因上游同源序列+20bp的pKD3配对序列
下游引物：50bp的基因下游同原序列+20bp的pKD3配对序列
  此方法敲除成功了。
  但是我用相同的策略敲除DnaK基因的时候却无论如何也筛不到交换菌株（即DnaK基因被氯霉素基因替换掉的）。用的是跟上面相同的pKD3配对序列，只是把前面50bp换成DnaK的上下游同源序列，实验方法与敲除ClpP基因时是完全一样的，可是就是敲除不掉。
  我想请教一下，这样的情况最可能是什么原因呢？是不是因为50bp同源臂，那么应该怎么设计同源臂的序列？我之前设计的50bp同源臂能够保证它与DnaK基因上下游的序列同源，但是没有考虑GC含量之类的其他条件，会有些什么因素影响引物设计呢？
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1楼 2015-03-28 19:29:36
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

你的引物设计应该没有问题，你有没有考虑过在做电转感受态时的问题，电转感受态制备时，要L-阿拉伯糖诱导，以及相应的OD600值得要求，还有就是电击杯的问题，电击杯如果有问题的话，也不会成功的。最后就是你诱导的温度问题，还有什么问题，后面再讨论吧
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3楼2015-05-31 13:37:37
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emma的小胖

新虫 (初入文坛)
没有人，有没有大神
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2楼2015-03-31 17:00:05
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