[求助] 关于PFU酶扩增

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1楼2012-07-17 18:55:43

shenye.judy

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Taq酶最后会给扩增产物加个A，之后正好可以用于T-A载体的连接。
PFU酶扩增的是你纯粹的产物，你可以再引物设计的时候给带上个AT之类的（建议再去查一下，我也是知道理论，具体做起来还是要搞得清楚些，少走弯路）。
但是跑胶没有跑出来的话，只能说明没有扩增出来，这个可能性就大了。
比如，你确定你的模版里，这个基因是表达的？你的酶没有失活？需要加镁离子吗（没用过，不确定）？

2楼2012-07-17 19:19:49

ximenzoe

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pfu是高保证的，没有A尾

3楼2012-07-18 08:48:33

123n

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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-18 13:57:27

楼主：你扩增的片段多长啊？是不是跑胶时间太久导致引物二聚体都木有？按理说应该至少有引物二聚体的！建议：dNTP量增加，引物量稍微增加点，别忘了pfu酶可是要热启动的哦~~ 预祝LZ试验顺利！！！

4楼2012-07-18 10:14:24

hlwnxfd2011

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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-18 13:57:39

高保真就是这样不易产生引物二聚体，现在你的问题是怎么扩出条带对吧。
1.你的Buffer含镁离子吗？
2.你只试了55摄氏度，你可以做个温度梯度。
3.你跑个内参看看是不是模板问题。
如果这些都试了还没带，那可能是你的引物问题。

5楼2012-07-18 11:07:22

genegop

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PFU的延伸速率比Taq慢，需要的时间是扩增片段长度（kb单位）×2（min）。如果你的扩增片段长度超过1kb的话，延伸2 min就不够，需要增加延伸时间。
另外，PFU有3'-5'外切酶活性，准备PCR体系时一定要最后加PFU，不然酶会切割引物。

6楼2012-07-18 12:10:19

sjjsy7

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2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-17 19:19:49
Taq酶最后会给扩增产物加个A，之后正好可以用于T-A载体的连接。
PFU酶扩增的是你纯粹的产物，你可以再引物设计的时候给带上个AT之类的（建议再去查一下，我也是知道理论，具体做起来还是要搞得清楚些，少走弯路）。 ...

是表达的，酶也是新买的，镁离子在buffer里！

7楼2012-07-18 12:41:46

sjjsy7

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4楼: Originally posted by 123n at 2012-07-18 10:14:24
楼主：你扩增的片段多长啊？是不是跑胶时间太久导致引物二聚体都木有？按理说应该至少有引物二聚体的！建议：dNTP量增加，引物量稍微增加点，别忘了pfu酶可是要热启动的哦~~ 预祝LZ试验顺利！！！

1000bp左右，三个基因，PFU酶热启动怎么做？？？？

8楼2012-07-18 12:43:45

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6楼: Originally posted by genegop at 2012-07-18 12:10:19
PFU的延伸速率比Taq慢，需要的时间是扩增片段长度（kb单位）×2（min）。如果你的扩增片段长度超过1kb的话，延伸2 min就不够，需要增加延伸时间。
另外，PFU有3'-5'外切酶活性，准备PCR体系时一定要最后加PFU，不然 ...

谢了！！知道了！！

9楼2012-07-18 12:45:10

sjjsy7

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5楼: Originally posted by hlwnxfd2011 at 2012-07-18 11:07:22
高保真就是这样不易产生引物二聚体，现在你的问题是怎么扩出条带对吧。
1.你的Buffer含镁离子吗？
2.你只试了55摄氏度，你可以做个温度梯度。
3.你跑个内参看看是不是模板问题。
如果这些都试了还没带，那可能是 ...

谢了，我今天试一试！

10楼2012-07-18 12:47:47