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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于PFU酶扩增
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sjjsy7

银虫 (小有名气)

[求助] 关于PFU酶扩增

最近用PFU酶想克隆几个水稻基因，可是死活扩不出，先说一下我的体系吧
     25ul体系      dd水14.75ul     10X PFU Buffer2.5ul     dNTP1ul   引物0.5ul      PFU酶0.3ul   temp 1ul
         退火温度55度，延伸2分钟
     最后跑胶的时候连引物二聚体也没有，是不是引物不行啊，还有就是我下一步是接T载体，有人跟我说用PFU扩最后还得另外加A尾巴，Taq酶不用，到底是个什么情况？
        还请哪位虫虫指点迷津！！！！！！！！
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1楼 2012-07-17 18:55:43
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shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-17 21:03:16
Taq酶最后会给扩增产物加个A，之后正好可以用于T-A载体的连接。
PFU酶扩增的是你纯粹的产物，你可以再引物设计的时候给带上个AT之类的（建议再去查一下，我也是知道理论，具体做起来还是要搞得清楚些，少走弯路）。
但是跑胶没有跑出来的话，只能说明没有扩增出来，这个可能性就大了。
比如，你确定你的模版里，这个基因是表达的？你的酶没有失活？需要加镁离子吗（没用过，不确定）？
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2楼2012-07-17 19:19:49
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ximenzoe

新虫 (初入文坛)
pfu是高保证的，没有A尾
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3楼2012-07-18 08:48:33
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123n

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-18 13:57:27
楼主：你扩增的片段多长啊？是不是跑胶时间太久导致引物二聚体都木有？按理说应该至少有引物二聚体的！ 建议：dNTP量增加，引物量稍微增加点，别忘了pfu酶可是要热启动的哦~~  预祝LZ试验顺利！！！
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4楼2012-07-18 10:14:24
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hlwnxfd2011

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sjjsy7: 金币+1, ★有帮助 2012-07-18 12:48:48
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-18 13:57:39
高保真就是这样不易产生引物二聚体，现在你的问题是怎么扩出条带对吧。
1.你的Buffer含镁离子吗？
2.你只试了55摄氏度，你可以做个温度梯度。
3.你跑个内参看看是不是模板问题。
如果这些都试了还没带，那可能是你的引物问题。
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5楼2012-07-18 11:07:22
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genegop

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-18 13:57:48
PFU的延伸速率比Taq慢，需要的时间是扩增片段长度（kb单位）×2（min）。如果你的扩增片段长度超过1kb的话，延伸2 min就不够，需要增加延伸时间。
另外，PFU有3'-5'外切酶活性，准备PCR体系时一定要最后加PFU，不然酶会切割引物。
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6楼2012-07-18 12:10:19
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-17 19:19:49
Taq酶最后会给扩增产物加个A，之后正好可以用于T-A载体的连接。
PFU酶扩增的是你纯粹的产物，你可以再引物设计的时候给带上个AT之类的（建议再去查一下，我也是知道理论，具体做起来还是要搞得清楚些，少走弯路）。 ...

是表达的，酶也是新买的，镁离子在buffer里！
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7楼2012-07-18 12:41:46
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 123n at 2012-07-18 10:14:24
楼主：你扩增的片段多长啊？是不是跑胶时间太久导致引物二聚体都木有？按理说应该至少有引物二聚体的！ 建议：dNTP量增加，引物量稍微增加点，别忘了pfu酶可是要热启动的哦~~  预祝LZ试验顺利！！！

1000bp左右，三个基因，PFU酶热启动怎么做？？？？
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8楼2012-07-18 12:43:45
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by genegop at 2012-07-18 12:10:19
PFU的延伸速率比Taq慢，需要的时间是扩增片段长度（kb单位）×2（min）。如果你的扩增片段长度超过1kb的话，延伸2 min就不够，需要增加延伸时间。
另外，PFU有3'-5'外切酶活性，准备PCR体系时一定要最后加PFU，不然 ...

谢了！！知道了！！
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9楼2012-07-18 12:45:10
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hlwnxfd2011 at 2012-07-18 11:07:22
高保真就是这样不易产生引物二聚体，现在你的问题是怎么扩出条带对吧。
1.你的Buffer含镁离子吗？
2.你只试了55摄氏度，你可以做个温度梯度。
3.你跑个内参看看是不是模板问题。
如果这些都试了还没带，那可能是 ...

谢了，我今天试一试！
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10楼2012-07-18 12:47:47
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