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sjjsy7

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 123n at 2012-07-18 10:14:24
楼主:你扩增的片段多长啊?是不是跑胶时间太久导致引物二聚体都木有?按理说应该至少有引物二聚体的! 建议:dNTP量增加,引物量稍微增加点,别忘了pfu酶可是要热启动的哦~~  预祝LZ试验顺利!!!

最好说说一下怎么做!!谢了!
11楼2012-07-18 12:50:27
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123n

木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by sjjsy7 at 2012-07-18 12:43:45
1000bp左右,三个基因,PFU酶热启动怎么做????...

就是把东西加好之后,放在PCR仪中,等到温度升到95度的时候再加pfu酶!!!!  因为pfu酶需要热启动,活性高!!!  1000bp很好扩的~加油!!!!!
12楼2012-07-18 14:33:47
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sunpeng

铜虫 (小有名气)

建议先用普通TAQ酶扩增看下能否扩增出条带,检验下PCR体系是否有问题。
13楼2012-07-18 17:00:06
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lishenchi

新虫 (初入文坛)

楼主,我跟你一样,扩不出来,买的是FERMENTAS的pfu酶。请问你也是吗???不过也许不是酶的原因。
14楼2012-07-18 20:14:30
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reallpf

木虫 (正式写手)

PCR没有产物就降低退火温度看看吧。Taq酶是自动加尾的,而你的酶不行,只要PCR结束后再加入0.5uLTaq酶72度30min就好了。
15楼2012-07-18 20:45:23
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sjjsy7

银虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by lishenchi at 2012-07-18 20:14:30
楼主,我跟你一样,扩不出来,买的是FERMENTAS的pfu酶。请问你也是吗???不过也许不是酶的原因。

就是这个公司的!!!
16楼2012-07-18 22:33:26
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sjjsy7

银虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 123n at 2012-07-18 14:33:47
就是把东西加好之后,放在PCR仪中,等到温度升到95度的时候再加pfu酶!!!!  因为pfu酶需要热启动,活性高!!!  1000bp很好扩的~加油!!!!!...

好的,谢了!!
17楼2012-07-18 22:34:55
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syn1985

木虫 (正式写手)

pfu扩增后最好用DNA产物回收试剂盒回收一下 然后加上buffer rtaq dntp 72度10-20分钟就可以加上A了
18楼2012-07-20 17:43:12
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chs4502

金虫 (小有名气)

你是要链接到T-载体中去的,用Taq或EX-taq会方便点。因为Taq酶会在你的目的片段末尾加上一个A,刚好和T-载体末端的T配对。而使用Pfu酶只能产生钝性末端,只能加上一个A以后才能与T-载体连接。
你P不出来的原因可能有以下几种:
(1)引物的问题,可以用primer5.0检测一下;
(2)退火温度的问题,建议跑个梯度。选择最合适的退火温度。pfu的退火温度比一般的taq酶的要低一点;
(3)pfu在没有dNTP的情况下能使模板解链,因此需要最后加;
(4)你的反应体系可以改良一下,dNTP可以提高到2ul,或者加入一点1%-5%的甘油,可以提高PCR产物的产量。
祝你实验顺利
19楼2012-10-26 18:17:35
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