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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于PFU酶扩增
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 123n at 2012-07-18 10:14:24
楼主：你扩增的片段多长啊？是不是跑胶时间太久导致引物二聚体都木有？按理说应该至少有引物二聚体的！ 建议：dNTP量增加，引物量稍微增加点，别忘了pfu酶可是要热启动的哦~~  预祝LZ试验顺利！！！

最好说说一下怎么做！！谢了！
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11楼2012-07-18 12:50:27
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123n

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sjjsy7 at 2012-07-18 12:43:45
1000bp左右，三个基因，PFU酶热启动怎么做？？？？...

就是把东西加好之后，放在PCR仪中，等到温度升到95度的时候再加pfu酶！！！！  因为pfu酶需要热启动，活性高！！！  1000bp很好扩的~加油！！！！！
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12楼2012-07-18 14:33:47
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sunpeng

铜虫 (小有名气)
建议先用普通TAQ酶扩增看下能否扩增出条带，检验下PCR体系是否有问题。
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13楼2012-07-18 17:00:06
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lishenchi

新虫 (初入文坛)
楼主，我跟你一样，扩不出来，买的是FERMENTAS的pfu酶。请问你也是吗？？？不过也许不是酶的原因。
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14楼2012-07-18 20:14:30
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reallpf

木虫 (正式写手)
PCR没有产物就降低退火温度看看吧。Taq酶是自动加尾的，而你的酶不行，只要PCR结束后再加入0.5uLTaq酶72度30min就好了。
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15楼2012-07-18 20:45:23
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by lishenchi at 2012-07-18 20:14:30
楼主，我跟你一样，扩不出来，买的是FERMENTAS的pfu酶。请问你也是吗？？？不过也许不是酶的原因。

就是这个公司的！！！
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16楼2012-07-18 22:33:26
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sjjsy7

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 123n at 2012-07-18 14:33:47
就是把东西加好之后，放在PCR仪中，等到温度升到95度的时候再加pfu酶！！！！  因为pfu酶需要热启动，活性高！！！  1000bp很好扩的~加油！！！！！...

好的，谢了！！
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17楼2012-07-18 22:34:55
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syn1985

木虫 (正式写手)
pfu扩增后最好用DNA产物回收试剂盒回收一下 然后加上buffer rtaq dntp 72度10-20分钟就可以加上A了
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18楼2012-07-20 17:43:12
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chs4502

金虫 (小有名气)
你是要链接到T-载体中去的，用Taq或EX-taq会方便点。因为Taq酶会在你的目的片段末尾加上一个A，刚好和T-载体末端的T配对。而使用Pfu酶只能产生钝性末端，只能加上一个A以后才能与T-载体连接。
你P不出来的原因可能有以下几种：
（1）引物的问题，可以用primer5.0检测一下；
（2）退火温度的问题，建议跑个梯度。选择最合适的退火温度。pfu的退火温度比一般的taq酶的要低一点；
（3）pfu在没有dNTP的情况下能使模板解链，因此需要最后加；
（4）你的反应体系可以改良一下，dNTP可以提高到2ul，或者加入一点1%-5%的甘油，可以提高PCR产物的产量。
祝你实验顺利
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19楼2012-10-26 18:17:35
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