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sjjsy7

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[求助] 关于PFU酶扩增

最近用PFU酶想克隆几个水稻基因，可是死活扩不出，先说一下我的体系吧
   25ul体系    dd水14.75ul    10X PFU Buffer2.5ul    dNTP1ul 引物0.5ul    PFU酶0.3ul temp 1ul
      退火温度55度，延伸2分钟
   最后跑胶的时候连引物二聚体也没有，是不是引物不行啊，还有就是我下一步是接T载体，有人跟我说用PFU扩最后还得另外加A尾巴，Taq酶不用，到底是个什么情况？

还请哪位虫虫指点迷津！！！！！！！！

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1楼 2012-07-17 18:55:43

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sjjsy7

银虫 (小有名气)

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引用回帖:

12楼: Originally posted by 123n at 2012-07-18 14:33:47
就是把东西加好之后，放在PCR仪中，等到温度升到95度的时候再加pfu酶！！！！因为pfu酶需要热启动，活性高！！！ 1000bp很好扩的~加油！！！！！...

好的，谢了！！

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17楼2012-07-18 22:34:55

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shenye.judy

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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amisking: 金币+4, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-17 21:03:16

Taq酶最后会给扩增产物加个A，之后正好可以用于T-A载体的连接。
PFU酶扩增的是你纯粹的产物，你可以再引物设计的时候给带上个AT之类的（建议再去查一下，我也是知道理论，具体做起来还是要搞得清楚些，少走弯路）。
但是跑胶没有跑出来的话，只能说明没有扩增出来，这个可能性就大了。
比如，你确定你的模版里，这个基因是表达的？你的酶没有失活？需要加镁离子吗（没用过，不确定）？